基于网络药理学方法探讨半边莲治疗2型糖尿病的作用机制

王知一 孙伟婷 姜申德 刘春艳

1华北理工大学药学院 河北唐山 063210；2天津大学药物科学与技术学院

国际糖尿病联盟发布数据，2019年全球约有4.63亿糖尿病患者，预计2030及2045年将分别增至5.78亿、7.00亿[1]。在我国糖尿病已经逐渐发展成为威胁人民健康的三种慢性疾病之一，过去的30年里，中国内地的糖尿病患者比例增长了17倍，其中2型糖尿病患者的比例高达90%～95%[2]。目前2型糖尿病无法治愈，主要是通过注射胰岛素及口服降糖药物来控制血糖；化学药物疗效明确，但毒副作用大，易导致低血糖、营养障碍及消化道反应等多种不良反应[3]。因而开发更为安全有效的抗2型糖尿病药物具有重要意义。有研究表明中医药具有较高安全性，故中药治疗2型糖尿病成为了新的趋势[4]。半边莲(Lobelia Chinensis Lour.)具有清热解毒、消肿利尿等功效[5]，含有大量黄酮类化合物[6]，黄酮类化合物槲皮素可以降低糖尿病大鼠的血糖浓度[7]、对体内胰岛素的含量增敏[8]，木犀草素可以改善小鼠食源性肥胖和胰岛素抵抗[9]，具有抗 2型糖尿病的活性。Shibano等[10]证实半边莲提取物Radicamines A 和Radicamines B具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，为降糖药物的研发提供了新的方向。本课题组前期研究合成了Radicamines A[11]和Radicamines B[12]，并通过体外试验验证其对α-葡萄糖苷酶和对小肠葡萄糖的吸收均具有明显的生物抑制效果[13-14]。但对于半边莲是否具有治疗2型糖尿病的效果尚未见系统性研究，故采用网络药理学的方法分析半边莲治疗2型糖尿病的潜在效应靶点及通路，为临床治疗2型糖尿病提供药理学基础和新的思路。

1 材料与方法

1.1软件与数据库 TCMSP数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php)[15]、OMIM数据库(https://omim.org/)、Drug Bank数据库(https://go.drugbank.com/)、TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)[16]、 Uniprot数据库( https://www.uniprot.org/)、DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)[17-18]、STRING数据库(https://www.string-db.org/)、Cytoscape 3.7.2软件以、Discovery Studio(2016，天津大学提供)软件、ChemDraw 14.0软件以及Chem3D 14.0软件、SwissTarget Prediction数据库(http://ns504526.ip-198-245-63.net/)、PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Metascape数据库(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)[19]、PDB数据库(http://www.rcsb.org/)[20]等。

1.2半边莲活性成分及标靶基因的获得 在中药系统药理分析平台(TCMSP)中，以“半边莲”为关键词对其成分进行搜索，筛选口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18的成分作为活性成分，并得到其CAS号。在文献中查找半边莲具有降糖活性的成分。在PubChem数据库搜索活性成分的CAS号查询其Canonical SMILES。在SwissTarget Prediction数据库输入活性成分的Canonical SMILES模拟其作用靶点。

1.3软件与数据库 以“Type 2 diabetes mellitus”为关键词，分别在OMIM数据库、Drug Bank数据库、TTD数据库中检索疾病相关靶蛋白，用Uniprot数据库查询靶蛋白对应的基因名称，得到疾病相关标靶基因。

1.4半边莲调控的2型糖尿病标靶基因 将半边莲活性成分对应的标靶基因与2型糖尿病相关标靶基因Venny图映射，得到半边莲调控的2型糖尿病标靶基因。

1.5GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 采用Metascape数据库对半边莲调控的2型糖尿病靶基因进行GO功能富集分析，以半边莲调控的2型糖尿病靶基因为检索词，在基因标识符栏中选择“official-gene-symbol”，基因背景栏选择“homo sapiens”，分析工具选择“functional annotation tool”。筛选P值<0.01的通路进行结果分析。采用Cytoscape3.7.2软件作“有效成分-活性靶点-代谢通路”网络图，分析三者相互关系。

1.6蛋白相互关系分析 将筛选的半边莲调控的2型糖尿病靶基因输入到STRING数据库中，设定物种为“Homo sapiens”得到其蛋白-蛋白相互作用网络图，分析半边莲治疗2型糖尿病的关键基因。

1.7分子对接验证网络药理学筛选结果 采用筛选出的关键基因在PDB数据库搜索得到蛋白，用有效成分与蛋白在Discovery Studio软件中进行分子对接。

2 结果

2.1半边莲中的有效成分 通过TCMSP数据库进行半边莲数据挖掘，获得半边莲含有的71个化学成分，其中符合OB、DL的活性成分17个。文献中半边莲具有降糖活性的成分2个、对应标靶基因152个。再根据OMIM数据库、Drug Bank数据库以及TTD数据库中得到的2型糖尿病潜在靶点基因与半边莲相关标靶基因的映射反推配伍得到可能存在治疗作用的有效成分共17个， TCMSP编号、分子名称、OB值和DL值见表1。

表1 半边莲中的有效成分

2.2疾病和药物相关靶点筛选 在OMIM数据库、Drug Bank数据库以及TTD数据库中得到的2型糖尿病潜在靶点基因716个。与半边莲靶点通过Venny图映射，获得共有靶点基因25个，见图1。

图1 2型糖尿病潜在靶点基因与半边莲标靶基因映射Venny图

2.3GO功能富集分析 将半边莲治疗糖尿病的25个靶点进行GO富集分析结果见图2。

图2 GO富集分析柱状图

由GO富集分析结果可知半边莲治疗糖尿病的25个靶点主要富集在生物过程上，共13条富集结果，其中有机羟基化合物运输、氧化还原过程和碳水化合物代谢过程参与的基因数目最多。在细胞组分中有3条富集结果，其中基因参与最多的是受体复杂。在分子功能有4条富集结果，其中基因参与最多的是外源性跨膜转运ATP酶活性和氧化还原酶活性。半边莲通过调节机体多种生物过程，从而发挥治疗糖尿病的作用。

2.4KEGG富集分析 KEGG通路富集分析，筛选P<0.01的通路共8条，结果见图3。其中基因参与最多的是胆汁分泌通路，其次是类固醇激素生物合成通路。见图4。

图3 活性靶点KEGG代谢通路气泡图

采用Cytoscape3.7.2软件将半边莲治疗糖尿病的有效成分、活性靶点和代谢通路绘制成“有效成分-活性靶点-代谢通路”网络，见图5。该网络总计节点50个，边80条。其中17个节点代表半边莲的有效成分，25个节点代表与药效成分效应的疾病靶点，8个节点代表通路。网络中的网络度值越大说明半边莲通过该靶点治疗疾病的可能性越大。其中槲皮素、金合欢素、香叶木素和金圣草黄素的网络度最大，可能是治疗糖尿病的关键成分，可作用于多个糖尿病靶点。

图5 半边莲“有效成分-性靶点-代谢通路”网络

2.5蛋白相互作用网络分析 将半边莲治疗2型糖尿病的25个靶点输入STRING数据库中，得到其蛋白-蛋白相互作用网络分析图，见图6。该网络图节点21个，边38条，平均节点度为3.04。由结果可知CYP1A2、CYP1A1和CYP2D6与其他蛋白的相互关联程度最高，可能是半边莲治疗2型糖尿病的关键靶点。

图6 蛋白-蛋白相互作用网络分析图

2.6分子对接验证网络药理学 将有效成分与关键靶点对接，结果见图7、8、9、10。有效成分和关键靶点结合能力与阳性对照药物格列吡嗪相当，优于二甲双胍。

图7 分子对接结果矩阵图

图8 MOL001790与CYP1A1分子对接图

图9 Radicamines A与CYP1A2分子对接图

图10 Radicamines B与CYP1A2分子对接图

3 讨论

半边莲中治疗2型糖尿病的关键成分有槲皮素、金合欢素、香叶木素和金圣草黄素等。槲皮素能调节氧化应激水平，增加对胰岛素的敏感性，从而发挥抗2型糖尿病作用[21-22]。金合欢素和金圣草黄素通过抑制α-葡萄糖苷酶和PTP1B信号通路的活性，延缓葡萄糖在胃肠道的吸收，增强胰岛素信号转导，改善胰岛素抵抗，从而发挥抗2型糖尿病的作用[23-24]。香叶木素通过抑制非酶糖基终产物(AGEs)形成的活性[25]，发挥防治糖尿病慢性并发症的作用[26]。

关键受体CYP1A2、CYP1A1和CYP2D6均属于细胞色素P450酶系家族。CYP450酶系家族是参与大多数临床药物代谢的主要代谢酶，糖尿病状态下P450酶的诱导或抑制可改变药物在体内的代谢及其活性、毒性代谢产物的形成，从而影响药物的治疗效果和临床用药安全性。细胞色素P450酶活性的改变也会导致花生四烯酸、雌二醇、视黄醇、睾丸酮等内源性物质的代谢紊乱，从而加重胰岛素抵抗并诱发糖尿病并发症的发生，因此细胞色素P450酶家族活性变化在糖尿病病情发展以及疾病治疗中具有重要地位[27]。

胆汁分泌通路是KEGG富集的关键信号通路，胆汁的主要成分胆汁酸作为一种有效的内分泌信号因子，通过与肠道菌群的相互作用来调节糖的代谢[28-29]，进而参与2型糖尿病的治疗。其次富集基因最多的是类固醇激素生物合成通路，类固醇激素生物合成通路与脂质代谢密切相关[30]，进而影响糖代谢参与2型糖尿病治疗。5-羟色胺能突触通路通过促进释放胰岛素，抑制胰高血糖素[31]，发挥对抗2型糖尿病的作用。这些信号通路可能在糖尿病的治疗中起协同作用。

综上所述，本研究基于网络药理学的方法，借助相关的数据库及软件，对半边莲抗2型糖尿病的的有效成分、作用靶点和信号通路进行了探索性研究，结果表明半边莲通过多成分、多靶点、多种信号通路协同发挥抗2型糖尿病的作用，为半边莲治疗2型糖尿病进一步的实验研究提供药理学基础和新的思路。