灵芝种质资源评价研究进展※

●王 飞 于 娅 王 娜 李艳军 王 鹏 霍云龙 宫国辉

（吉林省农业科学院经济植物研究所 吉林 长春 136105）

灵芝是我国传统的名贵中药材，拥有2000多年的历史[1]，早在医书《神农本草经》和《本草纲目》中就有记载，其具有明目、安神、坚筋骨、补肝益气等功效，久服可强身健体，素有“瑞芝” “仙草”的美誉[2]。现代研究表明，灵芝含有丰富的生物活性物质，如多糖、三萜、甾醇、多酚、氨基酸和微量元素等[3-5]，对提高免疫力、抗血栓、降血糖血压、改善肝功能、镇咳祛痰平喘、预防心脑血管疾病等具有一定的作用[6-9]。随着药用保健功能的开发和利用，灵芝越来越受到人们的青睐，需求量增加，栽培面积也逐年扩大。截至2018年底，我国灵芝产量约16 800万千克，产值近3000亿[10]。种质资源是灵芝生产和遗传育种的基础，其特异性、一致性和稳定性的好坏决定生产能否顺利进行以及育种工作能否成功，而对种质资源进行科学、系统的评价是合理利用的前提[11]。

1 灵芝种质资源概况

我国地理环境优越，灵芝种质资源丰富，分布较为广泛，北纬25°～45°间的29个省市有分布[12]，如海南、云南、贵州、福建、广西、广东、浙江、湖北、江苏、山东、吉林等。根据颜色的不同灵芝可分为赤芝、紫芝、青芝、白芝、黄芝和黑芝[13]，其中赤芝和紫芝已被纳入《中华人民共和国药典》。

我国灵芝育种研究工作者十分重视灵芝种质资源资源的收集和利用，在全国范围内开展了灵芝种质资源的调查评价、优异种质的筛选、野生菌株驯化、原生质体融合等一系列工作，选育出一批优良品种[14-19]。19个品种通过国家和省级审定，其中国审品种4个，分别为‘金地灵芝’‘山东泰赤-1’‘川芝6号’和‘G26’；省审品种15个，有‘荣保1号’‘灵芝昆仑山-6’‘湘赤芝1号’‘仙客来灵芝1号’ ‘芝102’‘仙芝1号’和‘上海市沪农灵芝1号’等[20]。

2 形态学评价

形态学评价是通过肉眼对灵芝菌丝体和子实体形态进行客观评价。评价指标一般包括菌落的浓密程度、颜色、菌丝的生长速度、色素的分泌情况、生育期、子实体性状和产量等，涉及从菌丝体到子实体的整个生长发育过程[11]。形态学评价是目前作物种质资源评价中最传统、经济、直观的方法。孟丽等[21]采用形态学评价对11个灵芝主栽品种的菌丝生长速度和长势、菌盖形状和色泽、孢子形态和产量进行对比，结果表明，‘泰芝’ ‘赤芝8号’‘赤芝H504’和‘赤芝H506’可作为生产品种，其菌丝长势强、子实体商品性状好，产 孢 多；‘赤 芝H505’‘紫 芝H503’‘黄 芝248’和‘鹿角H508’可作为观赏品种，其子实体出菇一致，性状和色泽好，产孢少。兰玉菲等[22]以29个灵芝种质资源为供试材料，以菌丝生长速度、菌盖直径、厚度、菌盖色泽、菌柄直径和长度、生物学效率作为评价指标，通过聚类分析将供试资源分为两个大类群，灵芝亚属和树舌亚属，其中灵芝亚属又分成3个亚类群，为引种提供参考。金鑫等[23]通过对5份不同的灵芝资源进行形态学评价，发现不同资源的菌盖直径、厚度、菌柄长度和转化率存在明显差异，黄芝生育期长、菌盖大且厚，转化率较高；‘圆芝8号’整齐一致，色泽好，转化率高；平芝生育期短，分支多，产孢量多；‘金地灵芝’表现中等，灵白整齐度较差。吴伯文[24]筛选了15个经原生质体单核化后杂交的灵芝菌株进行田间性状产量、子实体外形、抗杂能力的综合评价，获得2份优异的杂交菌株‘金山102’和‘金山120’。柯斌榕[25]通过对65个无柄灵芝杂交菌株的菌丝长势、抗杂能力进行评价，获得40个抗杂能力强且长势较好的菌株，经与杂交亲本的农艺性状对比评价，筛选出在产量上超亲遗传的菌株G13/19和G13/10；66个赤芝杂交菌株通过菌丝生长特性的评价，获得46个抗杂能力强且长势较好的菌株，其中5株菌丝生长速度超过亲本，对杂交菌株及亲本的折干率、生育期、产量、子实体形态等指标进行评价，X19/H4的子实体大小和产量优势明显，J7/AL22生育期短，属于早熟的菌株，J19/AL8商品性状较好，可为下一步的育种工作提供重要的参考依据。

3 药用成分评价

20世纪70年代科研工作者开始对灵芝成分和相关的药理药效展开研究。目前已知的灵芝药用成分包括多糖、三萜类、酚类、呋喃类、油脂类、核苷类、甾醇类等，其中多糖和三萜是不同灵芝种质资源药用成分评价的主要指标。郑林用[26]通过对18个来源不同的灵芝种质资源的多糖和三萜含量进行对比分析，发现紫芝多糖含量最高为2.348%，三萜含量最低仅0.371%，而京大灵芝三萜含量最高为5.788%，多糖含量最低，仅为0.879%，说明不同的灵芝资源药用成分含量差异显著。刘平[27]以18个灵芝菌株为供试材料，评价各菌株菌丝体的胞外多糖含量，筛选出多糖高产菌株‘荣保灵芝1号’。陈勇[28]对15个野生灵芝资源的多糖和三萜检测结果表明，野生菌株P2多糖含量最高，G、P2、X1和G7三萜含量超过5%，综合各资源的多糖和三萜评价结果，发现P2的药用成分最高。郭金英等[29]采用苯酚硫酸法对14个灵芝品种的多糖含量进行评价，发现多糖含量在1%以上的灵芝品种有3个，分别为野生白灵芝（3.05%）、野生云芝（2.44%）和‘泰山3号’（1.22%），其余11个品种的多糖含量较低，均在1%以下。陈凌华等[30]通过评价53份灵芝资源的药用成分，发现多糖含量由高到低的顺序为灵芝紫芝＞树舌灵芝＞密纹灵芝＞赤芝＞松山灵芝，结果表明不同亚属间多糖含量存在显著差异，这为灵芝种属间药用价值的研究提供了参考。目前研究工作者建立了多糖和三萜的HPLC和TLC 指纹图谱[31-33]，为灵芝种质资源的质量评价奠定基础。

4 分子生物学评价

分子生物学评价可在基因水平上直接反映生物体的本质区别，对灵芝DNA序列进行分析，不受环境条件和人为因素的影响，也不受基因是否表达的影响，对种质资源的评价更精准可靠。用于灵芝种质资源评价的分子标记主要有ITS、RAPD、ISSR、SRAP、SCAR、SSR。肖自添等[34]筛选10个ISSR引物对24份灵芝种质资源的遗传差异性进行评价，相似系数在0.71水平上分为4个类群，类群Ⅰ为美芝和杂交赤芝，特点为菌丝生长速度快，菌盖厚度薄；类群Ⅱ为野生灵芝；类群Ⅲ为菌盖近圆形灵芝；类群Ⅳ的特点为菌柄长、菌盖肾形。陈小敏等[35]采用ISSR和ITS分子标记技术对四川地区采集的野生灵芝资源进行遗传多样性评价，评价结果表明，ITS标记构建的系统发育树将供试的12份资源分成两类，即赤芝和紫芝；ISSR聚类结果在0.54水平上，同样也将供试资源分成两类，其中SICAU-6和SICAU-9相似系数最小，遗传距离最大，亲缘关系较远，为亲本的选配和遗传改良提供参考依据。李睿[36]基于RAPD和SRAP标记对24份灵芝种质资源扩增数据进行分析，RAPD的多态性比率为55.3%，将供试菌株分成2个类群；SRAP的多态性比率为53.4%，将供试菌株分成3个类群，评价结果为供试的24份种质资源的亲缘关系较近，遗传多样性水平较低。徐晓兰等[37]基于2012年公布的灵芝全基因组序列开发60对SSR引物，筛选扩增出24对多态性条带引物，26个供试菌株的相似系数分布在0.02～0.73，其中‘赤芝6号’和‘赤芝Ga66’的遗传距离最小，‘泰山’灵芝和‘赤芝KG’遗传距离最大，亲缘关系最远，在相似系数0.17水平上，26个菌株可分成4类，说明供试灵芝资源具有丰富的遗传多样性。许美燕等[38]关于152个灵芝菌株的聚类研究结果表明，在遗传距离为0.85处将供试菌株建成48个基因池，用ISSR和SRAP引物对48个DNA 池进行扩增，采用和ISSR引物（TTCCC）3和SRAP引物me3-em13获得4条特异性片段，经回收、连接转化、测序，设计特异引物，引物准确性验证，开发出4个可用菌株遗传相关性检测的SCAR标记，为灵芝种质资源遗传多样性评价提供快速可靠的特异性标记。

5 展望

我国灵芝种质资源丰富，随着研究的深入，越来越多的灵芝资源被发掘利用。目前在形态学方面，对于药用灵芝种质资源的评价指标主要集中在菌丝长势和子实体大小、颜色、形状及产量，而往往忽视了能带来最大经济效益的指标——孢子粉产量；对于观赏用灵芝种质资源的评价较少，子实体外观和产孢量可作为重要评价指标。因此，针对不同用途的灵芝资源评价指标应该有不同的侧重。

灵芝作为一种名贵的中药材，基于药用成分的评价尤为重要，不同资源的药用成分差异较大。筛选对提高免疫和抗衰老有疗效的资源时，可将多糖作为主要的评价指标；筛选对肝功能疾病有疗效的资源时，可将三萜作为主要的评价指标。同时研究表明，灵芝的药用成分含量与形态学性状没有相关性。因此灵芝种质资源的评价要权衡形态学性状中的重要指标和药用成分进行综合评价，建立资源的标准分级评价体系。

优良品种的选育是灵芝产业健康发展的前提，利用分子生物技术进行的遗传多样性评价能从DNA序列水平上反映种质资源间的亲缘关系，可为亲本选配提供参考依据，防止近交退化，提高育种和保种效率。目前已经开展了一定的灵芝种质资源分子生物学评价研究，在此基础上需要继续增加分子标记种类和数量，建立重要性状的基因定位，构建遗传连锁图谱，为灵芝的新品种选育工作奠定基础。