焦亡与视网膜相关疾病

黄泽宇 管怀进 季敏

焦亡是一种炎症相关的程序性细胞死亡，其特征为细胞膜上孔洞形成，细胞迅速肿胀及膜破裂，以致大量胞质内容物漏出[1,2]。细胞死亡命名委员会(Nomenclature Committee on Cell Death ，NCCD)于2018年提议将细胞焦亡定义为：一种很大程度上依赖于Gasdermin(GSDM)蛋白家族形成质膜孔，经常但并不总是由炎性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysterine-aspartic acid protease，caspase)活化导致的可调控的细胞死亡[3]。

焦亡由GSDM蛋白家族介导，其中Gasdermin D(GSDMD)和Gasdermin E(GSDME)是两种相对确定的焦亡执行者。目前已知的与焦亡相关的Caspase家族成员包括Caspase-1、3、4、5、8、11。其中Caspase-1能够被吡啉结构域蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3)、NLRP12、(absent in melanoma，AIM2)等经典的炎症小体活化，Caspase-4、-5、-8和-11能够识别细菌脂多糖，Caspase-3则能够被紫杉醇、5-氟尿嘧啶、顺铂等多种化疗药物激活。这些活化的Caspase会切断GSDM中的氨基端(Gasdermin -N-terminal cleavage product, GSDM-NT)和羧基端( Gasdermin-C- terminal cleavage product, GSDM-CT)结构域之间的连接，然后GSDM-NT可在细胞膜上齐聚形成膜孔，细胞由于渗透压变化迅速膨胀，并释放炎性细胞因子如白介素1β(Interleukin-1β, IL-1β)、白介素18 (Inter leukin-18，IL-18)等。而GSDM-CT可以折叠回GSDMD-NT以抑制其激活，对细胞焦亡具有抑制作用[3,4]。

焦亡对机体的作用犹如一把双刃剑：一方面，作为细胞死亡的方式之一，它与许多炎症性疾病的病理生理及预后具有明显的相关性；并且越来越多的研究表明，细胞焦亡促成了炎症性疾病的发生，会损害组织健康[6]。而另一方面，焦亡的积极作用表现在能够通过释放炎性细胞因子招募免疫细胞消除感染的病原体[7,8]；另外经研究表明，GSDME还可作为一种肿瘤抑制因子抑制肿瘤的生长[9]。

近年来，随着抗血管内皮生长因子(anti-vascular endothelial growth factor，anti-VEGF)等药物的广泛应用，视网膜疾病引起的视力受损有所减少，尤其是年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD,)和糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)。然而DR仍然是目前工作年龄人群首要的致盲性眼病；许多AMD患者仍会继续出现视力下降[10-13]。因此，为视网膜疾病寻找新型的治疗靶点是广大学者的重要使命。伴随着研究者对细胞死亡方式的理解进一步加深，自噬依赖性死亡、线粒体通透性转变驱动的坏死、焦亡、铁死亡等死亡方式为许多疾病的治疗提供了新的思路。近年来，通过对焦亡过程及调控机制的深入研究，一些能够作用于焦亡及焦亡通路中重要调控因子的药物正在逐渐被发掘并临床试验中。下文就近年来焦亡在视网膜相关疾病中的研究进展进行综述。

一、焦亡与DR

DR是一种糖尿病微血管并发症，据统计，2019年全球糖尿病患病率为9.3%(4.63亿人)，2030年将上升到10.2%(5.78亿)，到2045年将上升到10.9%(7亿)[14]。随着糖尿病患者的增多，DR的防治任务日益严峻。越来越多的证据表明，DR可使视网膜胶质细胞、视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE)细胞等发生线粒体功能障碍、线粒体自噬失调、NLRP3炎症小体激活及焦亡[15-17]。

近年来，硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)被认为与炎症小体激活、促氧化应激、促凋亡作用相关。而TXNIP基因沉默或药物抑制可减轻NLRP3炎症小体激活，使线粒体自噬通量趋于正常化，防止或减缓DR的进展[18]。Gu等[19]在高糖(high glucose，HG)培养的人视网膜微血管内皮细胞(human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs)中观察到miR-590-3p下调，通过作用于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4)和NLRP1诱导 HRMECs焦亡。并且IL-1β由细胞内释放亦可诱导miR-590-3p的下调，从而正反馈激活NOX4/ROS/TXNIP/NLRP3通路，促进炎症联级反应。Xi等[20]用高糖处理细胞，结果发现高糖可促进肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)表达和活性氧(reactive oxygen species,，ROS)产生，降低超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1) 的水平，并触发了NLRP3炎症小体激活及焦亡。此外，上调miR-130a可通过调节TNF-α/SOD1/ROS轴介导的RPE细胞焦亡，减轻高糖对RPE细胞的毒性作用。因此干扰miR-590-3p、miR-130a可能是预防和治疗DR的有效靶点。

二、焦亡与AMD

AMD是一种威胁视力的视网膜疾病，目前治疗效果并不令人满意。据估计，到2050年，全球AMD患者的数量将从2020年的1.96亿增加到2.88亿[21,22]。早期干预对防止AMD病情加重至关重要。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)细胞作为黄斑区的免疫防御细胞，其功能障碍是AMD重要的发病因素[23]。

Yang等[24]用淀粉样蛋白(Amyloidβ1-40 ，Aβ1-40)作用于RPE细胞模拟AMD病理状态，扫描电镜显示细胞肿胀呈气泡状，伴细胞膜破裂，为焦亡的典型形态学特征。酶联免疫吸附法检测IL-1β和IL-18水平升高。他们还发现枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides, LBP)可改善RPE细胞活力及形态，可通过抗齐聚和抗焦亡作用挽救Aβ1-40诱导的RPE细胞损伤，表明枸杞多糖可能成为有效的AMD治疗药物。Gao等[25]发现X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP )的降低会使RPE细胞发生焦亡，IL-18和IL-1β的分泌增多，揭示了caspase-1/XIAP/IL-18/ IL-1β轴可能成为AMD治疗中的应用靶点。Huang等[26]发现氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL)激活了人RPE细胞系ARPE-19的NLRP3炎性小体，caspase-1的表达和IL-1β的释放显著增加，而三联基序蛋白(tripartite motif-containing protein 31，TRIM31)可增强NLRP3泛素化，从而抑制人RPE细胞的NLRP3炎性小体和焦亡，TRIM31基因过表达可保护RPE细胞免受炎性小体活化和焦亡的影响。Sun等[27]观察到黄芩苷(baicalin)既可通过miR-223/NLRP3炎症小体减轻Aβ1-40诱导的RPE细胞焦亡及活力下降，又可减轻脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)的发生。这表明黄芩苷可能是一种潜在的AMD治疗候选者。Wooff等[28]在AMD小鼠模型中发现caspase -1相关的光感受器细胞死亡在很大程度上独立于NLRP3、Aim2等炎性小体，即抑制单个炎症小体不足以抑制炎症级联反应所致的焦亡。以caspase-1为靶点的治疗可能为延缓AMD的进展提供了更有希望的方法。RPE细胞中全反式视黄醛(All-trans Retinal，atRAL)异常聚集是AMD及Ⅰ型Stargardt病中RPE萎缩的原因。Liao等[29]发现atRAL异常积累时，活性氧(reactive oxygen，ROS)和组织蛋白酶释放增多会导致NLRP3炎性体活化，caspase-1/GSDMD、caspase-3/GSDME、IL-1β、IL-18等焦亡相关蛋白表达上升。并且通过抑制ROS，NLRP3炎性小体，caspase-1，组织蛋白酶B或组织蛋白酶D的产生均可保护RPE细胞免受atRAL相关的细胞毒性作用。

三、焦亡与视网膜脱离

视网膜脱离(retinal detachment，RD)是以视网膜神经感觉层与色素上皮层分离为特征的疾病，虽能使用视网膜复位手术来实现解剖复位，但60%的孔源性视网膜脱离患者术后视力低于20/40，且持续存在较差的视觉相关生活质量问题[30]。

Li等[31]在大鼠RD模型中观察到视网膜中焦亡水平升高。由于GSDMD-CT能够折叠回GSDMD-NT以抑制质膜孔的形成，对细胞焦亡具有抑制作用。因此他们在大鼠视网膜下注射重组腺相关病毒2/8 GSDMD-C(rAAV2/8-GSDMD-C, recombinant adeno-associated virus 2/8-GSDMD-C)。结果发现注射rAAV2/8 GSDMD- C组较对照组IL-1、TNF-α等表达降低，视网膜胶质细胞的激活亦减轻。表明rAAV2/8 GSDMD- C可降低RD后视网膜光感受器的坏死和凋亡，保护视网膜功能。此外，RD后rAAV2/8 GSDMD-C还可减轻视网膜胶质细胞的激活。GSDMD参与RD后光感受器的坏死，GSDMD- C过表达可阻断GSDMD的切割，减轻光感受器损伤。这表明作用于GSDMD-CT能够通过抑制焦亡减轻RD对视网膜的损伤。

四、焦亡与青光眼视神经损伤

青光眼是一组以杯状视神经乳头和视野损害为特征的异质性疾病。它是全世界最常见的导致不可逆转失明的原因。所有类型青光眼的共同特征是视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)丧失，视网膜神经纤维层变薄，视盘呈杯状。研究表明，青光眼性RGCs及其轴突的丢失伴随着视网膜胶质细胞群的改变，并且焦亡水平被检测到在青光眼动物模型视网膜中显著上升[32].

Chen等[33]发现焦亡在急性高眼压诱导的视网膜缺血性损伤和RGCs死亡中起关键作用，并且由NLRP12与NLRP3、NLRC4协同，以依赖Caspase-8-HIF -1α通路诱导IL-1β成熟。此外，成熟的IL-1β通过促进Caspase-8- HIF-1α- NLRP12/ NLRP3/ NLRC4通路和GSDMD的切割启动神经炎症正反馈回路，放大视网膜缺血损伤期间的炎症级联反应。该研究为焦亡和神经炎症在急性高眼压诱导的视网膜缺血损伤中的作用提供了新的见解，并提示靶向抑制Caspase-8-HIF-1α-NLRP12/ NLRP3/ NLRC4引发的神经炎症和焦亡可能是一种有前景的急性青光眼治疗策略。Zhang等[34]在急性高眼压大鼠模型中发现Caspase-1信号增多分布在视网膜神经节细胞层(GCL)和内丛状层(IPL)，并与神经标记物微管相关蛋白(microtubule- associated protein，Map2)共定位，由此得出结论急性高眼压可诱导大鼠视网膜神经元焦亡，并且给予适当剂量的褪黑素(melatonin,MT)可减轻视网膜神经元焦亡水平。Wan等[35]观察到LncRNA-H19在视网膜缺血/再灌注损伤(Ischemia- reperfusion，I/R)中会引发小胶质细胞lncRNA- H19表达增多，显著激活NLRP3/6炎症小体，导致小胶质细胞焦亡与神经元死亡。这些损伤被lncRNA- H19基因敲除有效抑制。因此lncRNA H19可以作为视网膜I/R损伤的关键治疗靶点。

Xue、Zhang等[36,37]在小鼠慢性高眼压模型中发现视网膜胶质细胞(包括小胶质细胞及Müller细胞)被明显激活，细胞内大量ATP被释放到细胞外基质，再通过ATP-P2X7R-NLRP3-Caspase-1炎性通路，诱导焦亡并释放大量细胞因子如TNF-α,CXC趋化因子配体1(C-X-C motifchemokine ligand-1，CXCL-1)、集落刺激因子1(colony-stimulating factor-1，CSF-1)、IL-6, IL-1β, IL-18, and IL-11等，启动炎症联级反应，并促成了RGCs的死亡。并且自噬作为一种代谢和一般稳态过程，在其中通过抑制NLRP3炎症小体的累积起到抗炎作用，能够保护神经细胞及视网膜的结构与功能。因此我们认为抑制视网膜中ATP-P2X7R-NLRP3- Caspase-1诱导的焦亡通路，或提高视网膜中细胞的自噬水平可能是保护RGCs和青光眼视神经损伤的有效方法[38-41]。

五、展望

焦亡作为由Gasdermin介导的细胞炎性死亡方式，通过GSDMD-NT在细胞膜中齐聚形成膜孔致胞膜破裂及胞质漏出。焦亡参与了许多感染性和慢性炎症性疾病的发病过程，但在某些条件下也可发挥积极作用。伴随着研究者对焦亡等细胞程序性死亡认识的不断深入，焦亡已经成为视网膜相关疾病新的治疗靶点，且应用价值已崭露头角。但目前的许多研究仍停留在临床实验阶段，需进一步深入研究我们期待其能尽早应用于各种视网膜相关疾病的治疗。