调节性T细胞的肿瘤靶向治疗研究进展

樊慧明 汪斌如 陈始明

恶性肿瘤仍是当今难以治愈的疾病之一，严重威胁人类的生命健康。2020年全球累计新发癌症病例数1 930万例，其中新发死亡病例数近1 000万例，且大多数癌种的死亡率居高不下［1］。目前，除了传统的手术、放疗及化疗外，肿瘤的靶向治疗和免疫治疗发展迅速，并取得了令人鼓舞的效果。调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）是一类具有强大负性免疫调节功能的T细胞亚群［2］，1995年Sakaguchi首次发现并将其命名为 Treg［3］，该细胞具有拮抗效应T细胞（effector T cell，Teff）及维持自身免疫稳态作用［4］。然而，近年来大量研究表明Treg细胞在肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中可抑制抗肿瘤免疫反应并促进肿瘤生长。当Treg细胞在肿瘤组织中异常表达时，能抑制正常抗肿瘤免疫反应并促进肿瘤生长［5］。因此，Treg细胞在肿瘤的免疫治疗和靶向治疗中具有巨大的应用前景。本文就Treg细胞的肿瘤靶向治疗研究进展作一综述。

1 Treg细胞与TME

Treg细胞首先通过趋化作用在肿瘤组织中募集，作为正常机体中本就存在的T细胞，Treg细胞表面表达的趋化因子受体CCR4会选择性地与趋化因子配体CCL22结合，而CCL22正好高表达于各类肿瘤组织中。诸多研究表明，TME中的CCR4/CCL22信号通路是Treg细胞向肿瘤组织趋化的主要源动力［6-9］。除了CCR4/CCL22通路外，CCR4/CCL17、CCR5/CCL5和CXCR4/CXCL12等趋化通路也参与其中。然后，Treg细胞在肿瘤组织中浸润后，会通过以下方式破坏Teff细胞的抗肿瘤免疫活性：⑴Treg细胞表达免疫抑制因子IL-10和IL-35，干扰淋巴细胞终末分化轴BLIMP1并启动 Teff凋亡信号，耗竭Teff［10］。⑵Treg细胞分泌TGF-β，而TGF-β不仅对Teff有抑制作用，还能作用于巨噬细胞和中性粒细胞而使其偏向抑制性表型［11-12］。⑶Treg细胞在TME中分泌颗粒酶B并以穿孔素依赖的方式直接杀伤Teff［13］。⑷Treg细胞在其表面表达一些特定分子如IL-2受体CD25、胞外核酸酶CD39/73、免疫检查点CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIGIT 、TIM-3及共刺激分子GITR、OX40等，通过多种途径发挥免疫抑制作用。因此，未来通过靶向Treg细胞在TME中的趋化途径及各个免疫抑制环节，有望抑制其在抗肿瘤反应中的作用，从而达到治疗肿瘤的目的。

2 Treg细胞的靶向治疗

2.1 靶向趋化因子通路

Treg细胞向肿瘤组织浸润时需要特定的趋化通路进行介导，如 CCR4/CCL22、CCR4/CCL17、CCR5/CCL5或CXCR4/CXCL12等，因此当利用药物阻断以上通路时，可以有效切断Treg细胞趋化途径，减少肿瘤组织内的Treg细胞数量，从而增强抗肿瘤免疫反应。

Mogamulizumab（KW-0761）是一种Fc区去糖基化的人源性抗CCR4单抗，主要用于治疗复发/难治性成人T细胞白血病［14］。该单抗与效应细胞上的Fcγ受体具有较高的亲和力，也有强大的抗体依赖的细胞毒作用，因此还可以靶向CCR4/CCL22而用于治疗Treg细胞浸润性肿瘤［15］。一项Ⅰ期临床试验采用Mogamulizumab治疗肺癌及食管癌患者，其中40%的患者在治疗过程中病情稳定且生存期延长，即使用最小剂量也能使患者外周血中的Treg细胞数量显著下降，证实了Mogamulizumab对Treg细胞耗竭的敏感性和高效性［16］。SUN等［17］也发现，Mogamulizumab能减少头颈部鳞状细胞癌小鼠的浸润性Treg细胞数量，并使IFN-γ、TNF-α和IL-2等细胞因子表达水平上调，说明抗CCR4疗法不仅能增强机体的抗肿瘤免疫反应，还可以抑制头颈部鳞状细胞癌生长。此外，在犬尿路上皮癌研究中发现，BRAF突变可刺激CCL17高表达并促进CCR4+Treg细胞向肿瘤组织浸润，而BRAF抑制剂达拉非尼可减少CCL17的产生，并阻断Treg细胞向癌灶募集趋化［18］。

除了CCR4/CCL22和CCR4/CCL17趋化通路外，CCR5/CCL5等趋化通路也在Treg细胞趋化浸润中发挥作用。TAN等［19］报道，在乳腺癌患者及相应的小鼠模型中，Treg细胞高表达CCR5而肿瘤细胞高表达其配体CCL5，应用CCR5抑制剂TAK-779后，Treg细胞向癌灶的迁移能力明显受阻，瘤体也显著缩小。目前，靶向CCR5/CCL5的药物Maraviroc、Leronlimab已应用于乳腺癌和结肠癌的临床试验中，靶向CXCR4的拮抗剂BL-8040也被报道可用于治疗胰腺导管癌［20-21］。然而，趋化因子受体-配体轴较复杂，因此靶向这些通路的药物的疗效仍不确定，其中有可能影响其他淋巴细胞功能。如有研究报道，Mogamulizumab的过度使用会使Treg细胞大幅减少而细胞毒性CD8+T细胞功能失控，导致严重的中毒性表皮坏死松解症［22］。因此，应用趋化通路抑制剂时需要严格掌握用药时机和剂量。

2.2 靶向胞外分子及通路

2.2.1 靶向CD25 Treg细胞经趋化作用浸润到TME后，通过一系列机制抑制了抗肿瘤免疫反应，其中Treg细胞表面特异性分子CD25因为可以高亲和度结合IL-2而发挥重要抑制作用。IL-2是免疫系统中的细胞生长因子，能活化Teff细胞，刺激NK细胞及巨噬细胞，促进B细胞增殖及分泌抗体，甚至还能促进Foxp3表达和Treg细胞分化。当TME中的Treg细胞通过CD25优先结合有限的IL-2后，其他免疫细胞则失去了IL-2的正常活化作用，从而使抗肿瘤免疫反应减弱［23］。因此，今后或可通过药物阻断CD25+Treg细胞与IL-2的结合作用，从而恢复正常的抗肿瘤反应。目前靶向CD25的药物主要有两种，即抗CD25免疫毒素和抗CD25单抗。

抗CD25免疫毒素Denileukin diftitox（DAB-IL-2，Ontak）最早用于治疗T细胞淋巴瘤，但其因导致致命性输血反应、毛细血管渗漏综合征等而退市。随后，ROGERS等［24］开发了一种新型融合蛋白IL2-R336A，其可选择性靶向结合CD25，在靶细胞膜上形成低聚孔并杀死荷瘤小鼠体内的Treg细胞，不仅增强了抗肿瘤免疫反应，还可作为抗肿瘤疫苗的佐剂使用，且较Ontak更安全、有效。ONDA等［25］制备了一种新型重组免疫毒素2E4-PE38，也可使乳腺癌、间皮细胞癌和结肠癌小鼠的病灶缩小。此外，还有研究证实，第二代靶向CD25的白喉融合毒素s-DAB-IL-2（V6A）能显著减少黑色素瘤小鼠体内的Treg细胞数量并抑制肿瘤生长，血管渗漏综合征发生率也明显减少［26］。尽管新型抗CD25免疫毒素在动物实验中获得了良好疗效，但是其临床应用尚很少见，因此其制备技术及对人体的用药安全性仍有待进一步研究。

人源化抗CD25单抗Daclizumab于2016年在欧盟和美国用于治疗复发性多发性硬化症，后因阻断IL-2/IL-2R信号导致靶向性差且毒副反应多而退市。7D4为一种结合CD25而不阻断IL-2/IL-2R信号的IgM，经其制备的抗CD25抗体RG6292与Daclizumab相比，不仅能同等水平耗竭人源性肿瘤组织内的Treg细胞，而且不影响Teff细胞的免疫功能，因此认为RG6292可作为新一代抗CD25抗体用于靶向Treg细胞的肿瘤免疫治疗［27］。

近红外光免疫疗法是一种利用抗体-光吸收剂复合物和红外线的新型免疫疗法，具有高度选择性，短时间内即可杀死肿瘤细胞而不损伤邻近正常组织。有研究利用靶向CD25的抗体-光吸收剂复合物成功选择性地消除了小鼠肿瘤模型中的瘤内Treg细胞［28］，提示该方法或可应用于靶向Treg细胞的肿瘤治疗，值得进一步深入研究。

2.2.2 靶向CD39/73 Treg细胞的胞外核酸酶CD39/73可将ATP转化为腺苷。当腺苷与Teff细胞表面的A2AR腺苷受体结合后，会激活其胞内的腺苷酸环化酶，上调cAMP，然后通过下游PKA及EPAC通路使Teff细胞失活，进而减弱抗肿瘤免疫反应［29］。近期开发的新药NE-siRNA CD73R可通过关闭CD73/腺苷通路增强Teff细胞的抗肿瘤免疫反应，从而明显抑制大鼠胶质瘤的生长［30］。

2.2.3 靶向免疫检查点 免疫检查点是指在免疫细胞上表达并调节免疫激活程度的一类共抑制分子，主要抑制过度的异常免疫反应，起到“免疫刹车”作用。在TME中，Treg细胞表面的多种免疫检查点如CTLA-4可与TME中的抗原提呈细胞（antigen-presenting cells，APC）相结合，并负性调节APC的免疫功能，从而间接抑制Teff细胞的抗肿瘤免疫活性［31］。因此，通过免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）选择性阻断Treg细胞表面的免疫检查点，可恢复APC的免疫功能，增强抗肿瘤免疫反应。但是免疫检查点也并非Treg细胞表面所特有，且目前有关Treg细胞上的免疫检查点靶向治疗研究仍有限，因此其靶点及其作用机制仍不明确。

细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）是Treg细胞表面非特异性免疫检查点，在活化的Teff细胞上也可存在。当CTLA-4与APC结合后，不仅能干扰正常的T细胞抗原受体（T cell receptor，TCR）信号，还能促使细胞凋亡，抑制Teff细胞活性［32］。Ipilimumab是第一个被FDA批准的靶向CTLA-4的IgG1型抗体，目前已广泛用于治疗晚期黑色素瘤，对非小细胞肺癌、肾细胞癌等也有一定疗效。Tremelimumab是另一种新型抗CTLA-4的IgG2型抗体，已用于黑色素瘤、结肠癌、胃癌和间皮瘤的临床研究中。以上两种药物均可有效上调Teff/Treg比值，促进效应性细胞因子IFN、TNF-α生成，从而杀死肿瘤细胞［33］。然而，鉴于CTLA-4在Treg细胞和Teff细胞表面均有表达，其ICIs的作用位点仍有争议；但是大量体内外研究表明该类抗体在经过Fc区域修饰后具有高度抗体依赖的细胞毒性作用和细胞吞噬作用，可选择性杀伤瘤内Treg细胞并扩增抗原特异性CD8+T细胞以及提高Teff/Treg比值，从而达到抗肿瘤治疗效果［34-36］。近年来，针对CTLA-4的治疗方法也在不断更新。如PAI等［37］开发了一种新型的条件性抗CTLA-4抗体，该抗体在前列腺癌小鼠模型中发挥抗CTLA-4作用的同时，还避免了对外周正常组织Treg细胞的免疫毒性作用，有效减轻了免疫治疗的毒副反应。KVARNHAMMAR等［38］开发的靶向CTLA-4和OX40的双特异性抗体ATOR-1015具有更高的肿瘤特异性，有望成为下一代新型抗CTLA-4药物。但是值得注意的是，不恰当地使用ICIs也会过度破坏体内正常组织的Treg细胞，造成免疫相关不良事件［39］。

程序性死亡受体PD-1是CD28超家族的一种跨膜免疫抑制蛋白，PD-1可与其配体PD-L1结合并干扰正常抗肿瘤免疫功能［33］。抗PD-1单抗Nivolumab已于2015年被FDA批准用于治疗不能切除或已经转移的黑色素瘤，以及转移性鳞状非小细胞肺癌。另一种新型的抗PD-1单抗Pembrolizumab可通过上调mTOR和MAPK抑制基因激活STAT1通路，增加CD4+初始T细胞向Th1、Th17分化的数量，并降低向Treg细胞分化的数量，从而减少成熟Treg细胞的数目并弱化其免疫抑制功能［40］。

淋巴细胞活化基因3（lymphocyte activation gene 3，LAG-3）是一种跨膜的CD4相关蛋白，在活化的Teff细胞上瞬时表达，而在Treg细胞上持久高表达，是继CTLA-4与PD-1之后的另一种新型免疫检查点。与CTLA-4类似，当LAG-3与APC相互作用后，会导致Teff细胞应答下调，从而减弱抗肿瘤免疫反应。IMP321是最早的一类靶向LAG-3的重组融合蛋白，在一项Ⅰ/Ⅱa期临床研究中，16例黑色素瘤患者接种了含有IMP321的肿瘤疫苗，其中13例患者瘤内CD8+T细胞应答率有所增高，且所有患者的CD4+T细胞应答率明显上升，表明靶向LAG-3可有效增强抗肿瘤免疫反应［41］。目前，针对LAG-3的单克隆抗体也不断被开发，其中Relatlimab（BMS-986016）是第一个人源性抗LAG-3单克隆抗体，且已被证明与抗PD-1抗体Nivolumab联合使用能更加安全有效地治疗进展性黑色素瘤［42］。

TIGIT为IG超家族的一类受体，在Teff细胞、NK细胞、Treg细胞上均有表达，并在限制适应性和先天性免疫应答方面起着重要作用，为近年来发现的新型免疫检查点［43］。在一项黑色素瘤与结肠癌小鼠模型研究中，TIGIT与肿瘤组织中CD8+T细胞失活和Treg细胞激活有关，且阻断该受体后肿瘤生长显著延迟，抗肿瘤活性明显增强［44］。

2.2.4 靶向共刺激分子 共刺激分子主要表达于Treg细胞和Teff细胞表面，根据结构特征分为免疫球蛋白超家族和肿瘤坏死因子受体超家族（tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF）。共刺激分子与其配体结合后形成的共刺激信号可诱导Treg细胞凋亡并促进Teff细胞的产生，因此可以利用相关激动性药物增强共刺激信号，从而增强抗肿瘤免疫反应［45］。GITR是一类TNFRSF共刺激分子，有研究报道，将一种编码了鼠源性GITRL的质粒通过基因枪注入荷瘤小鼠体内后，可观察到瘤内特异性CD8+T细胞表达了GITR共刺激信号，且该细胞有效抵抗了Treg细胞的免疫抑制作用，说明GITR共刺激分子可作为抗肿瘤免疫反应的潜在靶点［46］。OX40为另一种TNFRSF共刺激分子，目前已有Ⅰ期临床试验表明抗OX40单克隆抗体9B12可使瘤组织内Treg细胞的OX40优先上调，并增强Teff细胞及B细胞的抗肿瘤免疫反应，使部分晚期黑色素瘤患者的病情好转［47］。

2.2.5 靶向TGF-β/TGF-βR1 转化生长因子TGF-β由多种免疫细胞产生，其可以诱导Foxp3的稳定表达并促进Treg细胞免疫抑制功能。HOLMGAARD等［48］在乳腺癌小鼠模型中发现，转化生长因子β受体1（TGF-βR1）的小分子抑制剂Galunisertib能显著抑制Treg细胞的免疫抑制功能，增强抗肿瘤免疫反应。STRAUSS等［49］首创的双功能融合蛋白 M7824（MSB0011359C）则能同时阻断TGF-β与PD-L1信号，在晚期实体瘤患者中取得了肯定的疗效。

2.2.6 靶向VEGF/VEGFR2 肿瘤产生的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）不仅能促使瘤组织中的血管生成，增加肿瘤细胞的血供来源，还能以血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）依赖的方式诱导Treg细胞增殖，抑制抗肿瘤免疫反应［50］。Ramucirumab是一种IgG1型抗VEGFR2抗体，有研究显示靶向阻断VEGF-VEGFR2信号通路可抑制Treg细胞并参与抗肿瘤免疫治疗［51］。

2.3 靶向胞内分子及通路

2.3.1 靶向Foxp3 叉头状转录因子Foxp3是调控Treg细胞生长发育、生理功能以及维持免疫稳态的特异性分子。然而，Foxp3作为Treg细胞胞内分子，较其他表面分子（CCR4、CD25、CTLA-4）更难标记，因此许多研究结果并不理想。最新研究显示，一种TCR模拟型单克隆抗体Foxp3-#32可特异性识别Treg细胞表面的Foxp3衍生表位，通过ADCC作用有效清除卵巢癌腹水中的Treg细胞，证实TCR模拟型单抗能靶向Foxp3来清除瘤组织内的Treg细胞，达到治疗肿瘤的效果［52］。

2.3.2 靶向EZH2 EZH2是一种表达于T细胞内的组蛋白H3K27甲基转移酶，在Treg细胞激活时被诱导，并与Foxp3形成复合体来维持Treg细胞稳定和功能。EZH2基因缺失的荷瘤小鼠会表现出更强的抗瘤免疫活性，且EZH2抑制剂CPI-1205能诱导Treg细胞表型和功能改变，增强Teff细胞毒性，说明EZH2可作为Treg细胞免疫治疗新靶点［53］。

2.3.3 靶向PI3K PI3K通路可通过调节免疫细胞表面受体的信号转导发挥重要作用，如刺激T细胞相关的细胞因子表达、调控T细胞增殖、迁移和新陈代谢等［54］。PI3K抑制剂Wortmannin和Akt抑制剂Triciribine比一般的T细胞能更显著地抑制人外周血中的Treg细胞增殖能力，说明Treg细胞在增殖中更依赖PI3K-Akt信号通路，且PI3K抑制剂可显著降低荷瘤小鼠Treg细胞数量，抑制肿瘤细胞生长［55］。

3 小结

Treg细胞经趋化作用进入TME后，在各种胞内外分子及信号通路的调节下抑制抗肿瘤免疫反应，促使肿瘤生长。通过干预该过程的各个靶点，减少肿瘤组织中Treg细胞的浸润数目，削弱其免疫抑制功能，从而增强抗肿瘤免疫反应，达到靶向治疗肿瘤的效果。但是值得注意的是，Treg细胞是机体内维持免疫平衡的重要免疫抑制性细胞，盲目杀伤耗竭并不可取，因此后续药物的开发仍需要深入研究并寻找瘤内Treg细胞的特异性靶点，以降低毒副反应并提高疗效，从而让更多患者获益。