BTK抑制剂耐药机制及应对策略

刘康 王亮

B细胞受体（B cell receptor，BCR）信号通路在B细胞的增殖分化中发挥着至关重要的作用，该通路的异常可导致恶性B细胞淋巴瘤发生。布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton's tyrosine kinase，BTK）是BCR通路的关键酶，可被上游分子脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK）激活，并激活下游的磷脂酶 Cγ2（phospholipase Cγ2，PLCG2），最终促进核因子 κB（nuclear factor κB，NF-κB）核转位进而导致 B 细胞增殖［1］。BCR通路的异常激活可见于多种B细胞恶性肿瘤，主要包括慢性淋巴细胞性白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）/小淋巴细胞性淋巴瘤（small lymphocytic lymphoma，SLL），弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL），套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）和华氏巨球蛋白血症（Waldenstroms macroglobulinemia，WM）等［2］。BTK 抑制剂可下调BCR通路，抑制恶性B细胞增殖，在临床上已作为恶性B细胞淋巴瘤的靶向药物。伊布替尼（Ibrutinib）是第一个批准上市的BTK抑制剂，可与BTK的481位半胱氨酸位点共价结合并使其失活，与其机制相同的还有阿卡替尼（Acalabrutinib）、泽布替尼（Zanubrutinib）等［2］。但是，BTK抑制剂也有不足：一方面，BTK抑制剂对DLBCL的疗效较差；另一方面，随着药物的广泛使用，BTK抑制剂耐药也随之出现，而耐药可能与基因突变等因素相关。本文将针对BTK抑制剂的应用现状、耐药机制以及耐药应对策略进行综述。

1 BTK抑制剂应用现状

目前临床上常应用的BTK抑制剂主要有伊布替尼、阿卡替尼、泽布替尼、特布替尼（Tirabrutinib）、奥布替尼（Orelabrutinib）等，这些药物在淋巴瘤的治疗中取得了良好疗效。伊布替尼是第一代不可逆小分子BTK抑制剂，广泛应用于CLL、MCL、WM、DLBCL和中枢神经系统淋巴瘤［2］。伊布替尼与B细胞淋巴瘤2蛋白（B-cell lymphoma 2 protein，BCL-2）抑制剂维奈克拉（Venetoclax）的联合应用在CLL治疗中取得了良好效果［3］。研究表明伊布替尼和利妥昔单抗（Rituximab）联用虽然疗效较好，但是在治疗老年初治CLL时并不具有协同作用，因此有待进一步研究［4］。阿卡替尼是第二代不可逆BTK抑制剂，对BTK的选择性优于伊布替尼，且毒性更小，可用于治疗伊布替尼不耐受的患者，在耐药或不耐受的CLL患者中总反应率（overall response rate，ORR）和2年中位无进展生存（progression-free survival，PFS）率分别为 76.0%和75.0%［5］。奥妥珠单抗（Obinutuzumab）和阿卡替尼联用对初治及复发CLL患者的ORR分别达95%和92%，疗效优于其与伊布替尼联用，可能与阿卡替尼强大的单药疗效有关［6］。还有研究报道，阿卡替尼和R-CHOP化疗方案联用治疗Richter转化的DLBCL患者的18周PFS率仅为40%，但仍显著优于单用R-CHOP方案［7］。泽布替尼是第二代具有高度选择性的BTK抑制剂，能通过抑制Akt/mTOR通路及影响细胞代谢达到治疗效果［8］。泽布替尼广泛用于治疗MCL、WM、复发或难治性CLL/SLL患者［2］。头对头随机临床试验表明泽布替尼对WM患者的疗效和安全性优于伊布替尼［9］。泽布替尼与奥妥珠单抗联用对复发或难治性CLL和滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）患者的ORR分别为100%和72%［10］。特布替尼是不可逆BTK抑制剂，目前已被批准用于治疗原发性中枢神经系统淋巴瘤，ORR为64%［11］。特布替尼在不同恶性B细胞淋巴瘤中疗效不同，其中对CLL、MCL以及WM的疗效较好，但对DLBCL疗效较差［12-13］。奥布替尼是高度选择性不可逆BTK抑制剂，耐受性和安全性较好，在治疗复发或难治性CLL/SLL及MCL患者中，ORR分别为88.5%和82.5%［14-15］。

2 BTK抑制剂耐药现状及耐药机制

2.1 CLL耐药现状和机制

目前多项研究表明CLL患者较少出现原发性耐药，病初对BTK抑制剂均具有良好的反应性。如FURMAN等［16］在伊布替尼临床试验中发现仅5.3%的复发或难治性CLL患者出现疾病进展。MADDOCKS等［17］的临床试验结果显示，在12个月时，CLL患者累计Richter转化率为4.5%，但转化后中位生存期仅为3.5个月。有研究显示，随着伊布替尼应用时间延长，4年累积耐药率达19%，而CLL患者产生耐药性主要是因为获得性基因突变，包括BTK、PLCG2等［18］。

BTK突变是耐药性产生的主要机制，通过影响抑制剂和BTK的共价结合产生耐药性。研究发现，部分对伊布替尼耐药的患者发生了BTK突变，其481位半胱氨酸残基突变为丝氨酸（C481S），从而降低了伊布替尼和BTK的亲和力［16］。耐药突变以丝氨酸为主，但也可为苏氨酸。除以上两种突变外，C481位其他类型突变（如精氨酸、酪氨酸）虽然可以产生耐药性，但是会使BTK失去正常活性，因此临床上少见［19］。

PLCG2突变同样可导致CLL产生对BTK抑制剂的耐药性。LIU等［18］发现PLCG2第665位精氨酸可突变为色氨酸（R665W），这一突变使PLCG2能直接被BCR通路上的BTK上游分子激活，从而绕过BTK形成旁路产生耐药性。PLCG2还可发生L485F突变（485位亮氨酸突变为苯丙氨酸）和S707Y突变（707位丝氨酸突变为酪氨酸），S707Y、R665W和L485F突变有积累效应，均可介导耐药。

CLL原发或继发耐药性的产生还与染色体变异有关。有研究报道，TP53基因突变或17p缺失的CLL患者更容易发生治疗后复发，TP53基因突变或17p缺失也是CLL患者发生Richter转化的危险因素［20］。BURGER等［21］也在CLL耐药患者中发现部分伊布替尼耐药患者出现了8p缺失，并导致因子相关性凋亡受体配体（factor-related apoptosis inducing ligand-receptor，TRAIL-R）表达量不足，致使肿瘤细胞逃避凋亡，从而介导耐药。CLL耐药细胞增殖还与转录因子表达量有关，KAPOOR等［22］发现伊布替尼耐药CLL细胞株中抑癌转录因子FOXO3a表达下调可抑制抑癌基因蛋白酪氨酸磷酸酶基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）转录，最终表现为抑制细胞凋亡并促进细胞增殖，且PTEN通路可能与BTK抑制剂耐药性相关。此外，耐药CLL细胞的代谢途径也会发生改变。GALICIAVAZQUEZ等［23］发现伊布替尼耐药CLL细胞株脂肪酸氧化增强，提示脂肪酸氧化途径可能作为克服耐药的靶点。

2.2 MCL耐药现状和机制

MCL患者对BTK抑制剂的耐药率高于CLL患者，且原发性耐药较多。WANG等［24］进行的一项临床试验中，32%的MCL患者应用伊布替尼无效。EPPERLA等［25］也发现35%的复发或难治性MCL患者对伊布替尼产生原发性耐药，25%的患者在伊布替尼治疗过程中，出现疾病进展。JAIN等［26］报道在使用阿卡替尼治疗后复发的MCL患者中，有57.7%的患者因为疾病进展停用阿卡替尼。但是，与CLL患者不同的是，MCL耐药患者较少出现BTK及PLCG2突变，主要为染色体变异引发原发性耐药（包括6q、9p和13号染色体缺失）；同时，还可能与NF-κB通路异常激活、代谢重塑以及肿瘤微环境变化有关［2］。其中，NF-κB通路（尤其是NF-κB诱导激酶）异常激活在MCL细胞耐药中起到重要作用［27］。WU等［28］在部分伊布替尼耐药的MCL患者中发现半胱氨酸蛋白酶招募相关结构域（caspase-associated recruitment domain 11，CARD11）突变并可激活NF-κB，从而使MCL细胞产生耐药性。RAUERT-WUNDERLICH等［29］在MCL细胞株中也发现CD40L介导的不依赖BCR通路的NF-κB激活可以促进细胞增殖并表现出对BTK抑制剂的耐药性。细胞周期蛋白突变与MCL细胞对BTK抑制剂的耐药性有关，研究发现细胞周期蛋白CCND1突变可以防止自身经泛素-蛋白酶体途径降解，促进细胞增殖，进而表现为原发性耐药［30］。在代谢重塑方面，有研究报道，伊布替尼耐药的MCL细胞株氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）明显增强，三羧酸循环更倾向于以谷氨酸转化为α-酮戊二酸为原料，且OXPHOS抑制剂IACS-010759对耐药细胞株和MCL小鼠均有治疗作用，提示BTK抑制剂耐药可能与代谢变化有关［31］。

2.3 WM耐药现状和机制

WM患者多为获得性基因突变导致耐药，主要包括BTK和PLCG2突变，但少数原发性耐药可能与趋化因子受体CXCR4突变有关。XU等［32］发现6例对伊布替尼治疗无效的WM患者中有5例存在BTK突变，而其中4例同时伴有CXCR4突变。此外，WM的C481S位突变还可通过改变肿瘤微环境介导周围细胞产生耐药性。CHEN等［33］发现在髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MYD88）突变WM细胞中，C481S突变细胞可通过BTK-PLCG2-ERK1/2信号通路激活ERK1/2，并伴有促生长和促炎细胞因子释放，致使周围未发生BTK突变的肿瘤细胞产生耐药性。

2.4 DLBCL耐药现状和机制

DLBCL可分为活化B细胞型（active B cell，ABC）和生发中心B细胞型（germinal center B cell，GCB）。研究显示，伊布替尼对DLBCL患者疗效较差，常表现为原发耐药，在复发或难治性DLBCL患者中伊布替尼单药治疗的ORR仅为28%［34］。其他类型淋巴瘤（如CLL）转化为DLBCL后同样易表现出耐药性［17］。DLBCL患者原发耐药性机制较复杂，与多个基因突变及核内外分子通路改变有关。其中，有研究报道同时伴有MYD88和CD79b基因突变的DLBCL对伊布替尼相对敏感，而MYD88突变但CD79b基因正常的DLBCL患者易表现出原发性耐药，这也是不同类型DLBCL对伊布替尼反应性不同的原因之一［2］。部分ABC型的发生依赖于CD79突变所引发的BCR通路上调，因此对伊布替尼的反应性优于GCB型。有研究显示，伊布替尼对63%的ABC型患者无效，在GCB型患者中ORR仅为5%［35］。

BTK突变也与DLBCL的获得性耐药有关。CHEN等［33］发现MYD88基因和BTK的C481S位点突变的细胞可以通过BTK-PLCG2-ERK1/2通路激活ERK1/2，释放促生长和促炎细胞因子而改变肿瘤微环境，从而使未发生BTK突变的细胞产生耐药性。DLBCL对BTK抑制剂耐药性的产生还与经典自噬通路PI3K/Akt/mTOR有关，该通路上调可增强自噬从而逃避BTK抑制剂的杀伤作用［36］。KUO等［37］也发现，ABC型可发生PIM1蛋白突变，且该突变可通过上调mTOR促进肿瘤细胞产生耐药。此外，对BTK抑制剂耐药的DLBCL细胞增殖还与转录因子表达量改变有关。有研究发现在耐药细胞中出现抑癌转录因子FOXO3a下调，并抑制细胞凋亡而促进细胞增殖，因此促进FOXO3a表达有可能是解决BTK抑制剂耐药的途径，值得进一步研究［22］。

3 BTK抑制剂耐药的应对方法

3.1 可逆性BTK抑制剂

目前研究显示选用非共价结合的可逆性BTK抑制剂对耐药细胞株有效。REIFF等［38］发现BTK抑制剂GDC-0853（Fenebrutinib）可与BTK可逆性非共价结合，且不依赖于C481位点，因此不受突变影响。GDC-0853不同于伊布替尼，其对表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）和IL-2诱导型T细胞激酶（IL-2 inducible T-cell kinase，ITK）没有抑制作用，毒副作用更小。临床试验证明该药对C481S突变的B细胞型非霍奇金淋巴瘤有效［39］。REIFF等［40］发现BTK可逆性抑制剂ARQ 531对伊布替尼耐药小鼠有效，ARQ 531可以与ATP竞争BTK的磷酸化位点，对C481S突变的BTK甚至是PLCG2突变细胞株都有抑制作用，但具体效果有待进一步观察。目前仍在研究阶段的可逆性BTK抑制剂还包括维卡替尼（Vecabrutinib），LOXO-305（Pirtobrutinib）等［2］。研究显示，LOXO-305对耐药CLL患者的ORR为67%，对BTK的C481突变CLL患者的ORR为71%，对耐药MCL患者的ORR为52%，说明LOXO-305对耐药患者有效［41］。

3.2 联合其他靶向药物

BTK抑制剂与其他靶向药物联用可增强对肿瘤细胞的选择作用，重塑肿瘤细胞中的分子通路，增强其对靶向药物的敏感性［42］。有研究表明BTK抑制剂的使用增强了CLL细胞对维奈克拉的敏感性，提示联用维奈克拉可能是解决耐药问题的潜在途径［43］。JONES等［44］研究显示，对伊布替尼无效或不耐受的CLL患者应用维奈克拉治疗有效，在BTK或PLCG2突变的患者中ORR可达71%。此外，BCL-2抑制剂也可与其他药物联用，如维奈克拉与PI3K/Akt/mTOR通路抑制剂联用可抑制伊布替尼耐药MCL细胞株［45］，这也是值得探索的方向。

3.3 降低BTK含量

有研究显示下调BTK表达可抑制BCR通路。BOTTONI等［46］发现使用组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂艾贝司他（Abexinostat）可以提高CLL和MCL细胞株中以BTK为靶点的miRNA含量，从而减少BTK表达，且对C481S突变的BTK同样有效，和伊布替尼联用在细胞和动物实验中均取得了良好效果，提示该法可能是解决耐药的途径。此外，促进BTK降解也是值得研究的方向。如有研究将伊布替尼、蛋白水解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chimeras，PROTACS）和泊马度胺（Pomalidomide）组合为新药，结果发现该药可明显抑制C481S突变的DLBCL细胞株增殖，说明C481S突变BTK经泛素-蛋白酶体途径降解增强［47］。另有研究显示，热休克蛋白 90（heat shock protein 90，Hsp90）抑制剂（AUY922和SNX-5422）对伊布替尼耐药的MCL细胞株以及人源型组织异种移植模型有抑制作用，Hsp90抑制剂主要通过诱导BTK（包括突变体）降解从而抑制下游通路发挥作用，但具体作用仍需临床试验验证［48-49］。

3.4 抑制BTK的上下游通路

MYD88基因突变与WM和ABC-DLBCL耐药性相关，MYD88突变后可激活BTK上游的SYK分子进而激活BTK，有研究表明SYK抑制剂与伊布替尼联合应用可抑制MYD88突变的肿瘤细胞增殖［50］，因此抑制BTK上游位点或可作为应对耐药的手段。LIU等［18］发现PLCG2突变耐药CLL细胞株中产生了旁路通路，即上游分子可绕过BTK直接激活突变的PLCG2，因此抑制BTK上游分子SYK可有效抑制细胞株增殖。直接或间接抑制NF-κB也表现出解决耐药性的潜力。SABA等［51］发现半胱氨酸蛋白酶黏膜相关性淋巴瘤转运体1抑制剂MI-2能抑制NF-κB核转位，从而抑制伊布替尼耐药CLL细胞株增殖。HING等［52］也报道核输出蛋白 1（exportin-1，XPO-1）抑制剂塞利尼索（Selinexor）可以防止抑癌蛋白p53和FOXO3a等转出，从而抑制耐药CLL细胞株增殖。还有研究显示，塞利尼索和伊布替尼联用可以通过抑制NF-κB通路阻碍伊布替尼耐药MCL细胞株增殖，提示两药联用可降低耐药性［40］。SUN等［53］还发现BET蛋白溴域拮抗剂JQ1可直接抑制NF-κB的BET蛋白溴域-4进而下调其下游通路，分别与BCL-2抑制剂ABT-199合用均可抑制伊布替尼耐药MCL细胞株增殖。

3.5 CAR-T细胞免疫疗法

嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）免疫疗法已广泛用于治疗复发或难治性白血病，多款CD19靶向CAR-T产品已获批，包括Tisagenlecleucel，Axicabtagene Ciloleucel等。目前研究显示，CAR-T疗法对BTK抑制剂耐药的MCL和CLL患者有效。WANG等［54］进行的一项临床试验中有88%的复发或难治性MCL患者用BTK抑制剂难以治疗，但是CAR-T疗法的客观反应率达85%，完全缓解率为59%。TURTLE等［55］研究也显示，对伊布替尼无效的CLL患者应用CAR-T治疗后ORR可达74%。临床试验也证实伊布替尼联合CAR-T疗法可降低CLL患者发生细胞因子释放综合征的概率，总体疗效优于单独CAR-T疗法，提示两者联用能取得更好的治疗效果［56］。

3.6 通过其他通路抑制肿瘤细胞增殖

PI3K/Akt/mTOR通路是肿瘤细胞存活的关键通路，在耐药DLBCL细胞中，有研究发现利用PI3K-β/δ抑制剂KA2237可以通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路从而抑制伊布替尼耐药DLBCL细胞株增殖［36］。PIM1抑制剂与伊布替尼合用也可协同抑制NF-κB，从而抑制耐药ABC型DLBCL细胞株增殖［37］。此外，干涉细胞周期对逆转耐药细胞株也有效。SUN等［53］研究发现NF-κB抑制剂JQ-1联合周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）4/6抑制剂帕博西尼（Palbociclib）可抑制耐药MCL细胞株增殖。ZHAO等［57］也发现伊布替尼耐药的MCL细胞中基因转录表达发生了重编，且耐药肿瘤细胞株对CDK9抑制剂敏感性增强，提示使用细胞周期蛋白抑制剂可能对耐药患者有效。

4 小结

综上，BTK抑制剂对恶性B细胞淋巴瘤疗效显著，但随着伊布替尼等BTK抑制剂的广泛应用，耐药问题也成为亟需解决的问题。未来进一步明确具体的BTK抑制剂耐药机制，通过换用非共价结合的新型BTK抑制剂、联合其他靶向药物、降解BTK蛋白，利用CAR-T疗法或重塑代谢等方式，可能有助于克服BTK抑制剂耐药，让恶性B细胞淋巴瘤患者再次获益。