沉默LAMC2基因对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的影响

黄莹莹 李海朋 裴 浩

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)来源于口腔上皮细胞，是头颈部最常见的恶性肿瘤，已被列为世界第八大恶性肿瘤，由于其具有高发生率、高致死率和高转移率，所以OSCC一直都是临床工作者的关注重点。层粘连蛋白γ2(laminin γ2 chain gene，LAMC2)是层粘连蛋白家族中的一员，研究发现，LAMC2在食管鳞癌中高表达[1]，此外，LAMC2可增强卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性，通过调节细胞赖以生存的微环境的pH值，促进胰腺癌细胞的清洗和迁移[2-3]。血清LAMC2可作为肝癌预后的诊断标志物[4]。Wang等研究报道称人OSCC细胞分泌的细胞外囊泡中富集大量LAMC2，可促进体外淋巴管再生[5]，但该基因对癌细胞的恶性行为学的影响未进行探讨，因此本研究以人舌鳞癌细胞TSCC为研究对象，探讨LAMC2对癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响，旨在为临床治疗OSCC提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人OSCC细胞CAL-27购自中科院上海细胞研究所。

1.2 试剂与仪器

含有si-LAMC2、LAMC2-NC、LAMC2、LAMC2-NC的pcDNA3.1重组质粒购自上海吉玛生物科技有限公司；脂质体LipofectamineTM购自美国Thermo公司；MTT试剂盒购自美国Abcam公司；逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒以及PCR引物购自大连宝生物工程有限公司；神经钙粘蛋白(N-cadherin，N-cad)、上皮钙粘蛋白(E-cadherin，E-cad)、波形蛋白(vimentin)抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；多功能酶标仪购自美国Bio-TEK公司；荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.3 细胞培养和转染

将CAL-27细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中，每2 d更换一次培养基，待细胞生长至80%时，0.25%胰蛋白酶消化，并传代，待细胞传至第4代时用于实验。

将对数生长期的细胞重悬，制成细胞密度为1×105的细胞悬液，接种于96孔板，置于培养箱中培养，待细胞融合度达到80%时。将细胞随机分为对照组、si-NC组、si-LAMC2组、LAMC2-NC组、LAMC2组。对照组细胞不做任何处理，其余4组分别转染si-NC、si-LAMC2、LAMC2-NC、LAMC2，显微镜下观察转染效果，待转染成功率达到85%时，进行以下实验。

1.4 qRT-PCR法检测LAMC2的表达

转染48 h后，收集各组细胞，利用RNA试剂盒提取细胞中总RNA，分光光度计测定RNA浓度和纯度，利用逆转录试剂盒，将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板，GAPDH为内参基因，进行PCR扩增，反应程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40个循环，数据采用2-△△CT法计算LAMC2的表达。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5 MTT法检测细胞存活率

转染48 h后，收集细胞将细胞重悬，以5×103/个细胞/孔的密度接种于24孔板，培养箱中培养24 h后，换含有0.5% MTT溶液的培养基继续培养4 h，弃去培养基，每孔中加入100 μl DMSO，振荡混匀后，置于酶标仪上测定波长570 nm处的吸光度(A值)，计算细胞存活率，细胞存活率(%)=(实验组A值/对照组A值)×100%。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率

转染48 h后，3000 r/min离心10 min，离心半径8 cm，收集对数生长期的细胞。冰PBS清洗细胞2次，加入400 μl Binding Buffer将细胞重悬，加入5 μl annexin V避光反应20 min，再加入4 μl碘化丙啶，振荡混匀后，室温避光反应15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.7 Transwell实验检测侵袭细胞数

转染48 h后，无血清培养基将细胞重悬，制成密度为1×105个/ml的细胞悬液。将100 μl细胞悬液接种于经Matrigel基质胶包被的Transwell小室的上室中，下室中加入含20%胎牛血清的培养基，在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养24 h后，弃掉下室中的培养基，棉签擦去上室膜上的细胞，甲醛固定下室中入侵的细胞，0.5%结晶紫染色10 min，显微镜下观察并计数。

1.8 蛋白印迹法检测细胞中E-cad、N-cad、vimentin蛋白相对表达量

转染48 h后，收集细胞，加入40 μl RIPA裂解液，4 ℃ 12000 r/min离心10 min，收集上清液，BCA法测定蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液后，100 ℃煮沸10 min使蛋白处于稳定状态。凝胶电泳，每孔20 μl蛋白样品，80 v电泳20 min，使蛋白样品至分离胶后120 v恒压电泳2 h，电泳结束后，0.3 A恒流湿转2 h，将蛋白湿转至PVDF膜上。TBST洗膜3次，5 min/次，室温封闭1 h，E-cad、N-cad、vimentin、GAPDH一抗(1∶1000)4 ℃孵育过夜，二抗(1∶5000)室温孵育2 h，TBST洗膜3次，5 min/次，ECL法显色，Image J软件分析蛋白条带灰度值，目的蛋白相对表达量以目的蛋白条带灰度值/内参GAPDH灰度值表示。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 qRT-PCR检测结果

LAMC2表达组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组和si-NC组比较，si-LAMC2组LAMC2表达降低(P<0.05)；与对照组和LAMC2-NC组比较，LAMC2组LAMC2表达升高(P<0.05)；与si-LAMC2组比较，LAMC2组LAMC2表达升高(P<0.05)，见表2。

表2 LAMC2表达量比较

2.2 细胞存活率检测结果

细胞存活率组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组和si-NC组比较，si-LAMC2组细胞存活率降低(P<0.05)；与对照组和LAMC2-NC组比较，LAMC2组细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05)；与si-LAMC2组比较，LAMC2组细胞存活率升高(P<0.05)，见表3。

表3 细胞存活率比较

2.3 细胞凋亡率检测结果

细胞凋亡率组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组和si-NC组比较，si-LAMC2组细胞凋亡率升高(P<0.05)；与对照组和LAMC2-NC组比较，LAMC2组细胞凋亡率降低(P<0.05)；与si-LAMC2组比较，LAMC2组细胞凋亡率降低(P<0.05)，见表4。

表4 细胞凋亡率比较

2.4 侵袭细胞数检测结果

侵袭细胞数组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组和si-NC组比较，si-LAMC2组侵袭细胞数减少(P<0.05)；与对照组和LAMC2-NC组比较，LAMC2组侵袭细胞数增多(P<0.05)；与si-LAMC2组比较，LAMC2组侵袭细胞数增多(P<0.05)，见表5。

表5 侵袭细胞数比较

2.5 蛋白印迹法检测结果

E-cad、N-cad、vimentin蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组和si-NC组比较，si-LAMC2组E-cad蛋白相对表达量升高，N-cad、vimentin蛋白相对表达量降低(P<0.05)；与对照组和LAMC2-NC组比较，LAMC2组E-cad蛋白相对表达量降低，N-cad、vimentin蛋白相对表达量升高(P<0.05)；与si-LAMC2组比较，LAMC2组E-cad蛋白相对表达量降低，N-cad、vimentin蛋白相对表达量升高(P<0.05)。见表6、图1。

表6 E-cad、N-cad、vimentin蛋白相对表达量比较

注：A为对照组;B为si-NC组;C为si-LAMC2组;D为LAMC2-NC组;E为LAMC2组。

3 讨论

头颈部常见的恶性肿瘤中，约90%以上为OSCC[6]，其病因包括遗传、环境、感染等因素，好发于40～60岁烟酒嗜好者。目前对于OSCC的治疗以手术、放化疗及免疫治疗为主，虽然治疗手段已取得巨大进展，但患者5年生存率仍不理想，仅有50%[7]。OSCC可发生早期颈部淋巴结转移，具有极高的隐匿性，据统计，约40%患者早期即发生隐匿性颈部淋巴结转移，导致术后复发率极高，这可能与高病死率有关。因此寻找新的治疗靶点对OSCC患者预后不良具有重要意义。

层粘连蛋白是一类大分子糖蛋白，主要存在于上皮细胞、神经视网膜细胞的基质上，该分子蛋白通常由α链、β链和γ链组成，形成十字形结构[8]。LAMC2、LAMB3、LAMA3三个亚基组成异三聚体糖蛋白层粘连蛋白5，特异性表达于上皮细胞，在上皮细胞的迁移过程中具有重要作用。LAMC2仅在层粘连蛋白5中存在，对层粘连蛋白5的生理功能具有重要作用。LACM2已被报道与多种肿瘤的发生有关，Huang等[9]研究发现LAMC2过表达可预测结直肠癌患者预后不良，并促进癌细胞增殖、迁移和侵袭。LAMC2在喉癌细胞和组织中高表达，且LAMC2表达水平与TNM分级、淋巴结转移、分化和总生存期相关，此外LAMC2显著促进细胞增殖和细胞活力，可显著逆转西妥昔单抗抑制喉癌细胞增殖的作用[10]。长链非编码RNA00511通过海绵吸附于miR-765上调LAMC2的表达，促进舌鳞状细胞癌的进展[11]。由此可见，LAMC2基因可能成为治疗癌症的新的治疗靶点，但是LAMC2对OSCC癌细胞行为学的影响鲜有报道，因此本研究以CAL27细胞为研究对象，上调或敲降细胞中LAMC2的表达，检测癌细胞的增殖、凋亡和侵袭能力。结果显示：过表达LAMC2后癌细胞增殖和侵袭能力增强、凋亡率降低，敲降LAMC2的表达后，癌细胞增殖和侵袭能力减弱，凋亡率升高。结果提示：LAMC2促进OSCC的恶性行为学。

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一个复杂的转化过程，发生在上皮细胞和间质细胞之间，当上皮细胞受到某些刺激因素时，上皮细胞丢失原有特性，形态由原来的规则形态转变成梭形的不规则形态，细胞骨架发生重构排列，细胞极性改变，使其具有间质细胞特性，极性改变提高细胞迁移能力，增强对周围组织的侵袭[12]。该过程常发生于胚胎发育、组织纤维化以及癌细胞迁移和侵袭过程，所以在多数肿瘤的迁移和侵袭中均发生上皮细胞向间质细胞转化的过程。Wang等[13]研究发现GIT1诱导EMT过程促进肝细胞癌迁移和侵袭。miR-29b抑制EMT过程可降低癌细胞迁移和侵袭能力，以及血管再生能力[14]。Okada等[15]报道称LAMC2逆转EMT过程可抑制胰腺癌的进展并增强化疗药物敏感性。发生EMT主要表现在上皮细胞表面标记蛋白E-cad表达下降，间质细胞表面标记物N-cad和vimentin蛋白表达上升，E-cad属于钙粘蛋白家族成员，主要介导细胞间连接和黏附，N-cad和vimentin蛋白与癌细胞迁移侵袭、化疗药物耐药、预后不良等密切相关。

既往研究表明，层粘连蛋白5的3个亚基LAMC2、LAMB3、LAMA3均可促进EMT过程从而癌细胞发生迁移和侵袭[16]。本研通过蛋白印迹法检测LAMC2对OSCC细胞癌中E-cad、N-cad、vimentin蛋白表达情况。结果显示：上调LAMC2后，E-cad蛋白表达降低，而N-cad和vimentin蛋白表达升高，敲降LAMC2后各蛋白表达出现相反趋势。结果提示：LAMC2促进OSCC的EMT过程。

综上所述，LAMC2促进OSCC癌细胞增殖和侵袭、抑制凋亡，其可能是通过诱导EMT过程发挥调控作用，为临床治疗OSCC提供理论依据。