胰腺癌中桥粒斑菲素蛋白3基因和蛋白的表达及其功能的生物信息学分析

裴 磊 节阳华 胡 悦 朱 玲 王 宁

胰腺癌(pancreatic cancer)作为最为常见的消化道肿瘤，发病率连年上升，5年生存率仅9%[1-2]，其高死亡率与不典型的早期症状和极易发生肝脏转移有关。近100年，肿瘤治疗在靶向、免疫等方面日新月异，许多患者因此而受益，甚至得到根治，但仍有部分患者因就诊晚，缺乏有效的治疗方法，治疗效果较差。目前国内外医学研究者展开了多项实验，试图获得治疗胰腺癌的新诊治靶点。桥粒斑菲素蛋白3(Plakophilin 3,PKP3)可以影响细胞信号转导和细胞粘附，在肿瘤发生中起重要作用。PKP3蛋白已被证明在多种癌症中发挥作用,如乳腺癌、下咽癌、胃癌、黑色素瘤及其他类型肿瘤，但目前尚无研究阐述PKP3在胰腺癌中的分布与其生物学功能。本研究通过生物信息学分析PKP3蛋白在不同组织、不同期别胰腺癌组织中的表达，与胰腺癌患者预后的关系及其发挥的生物学功能，阐述其在胰腺癌发生、发展过程中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 PKP3在胰腺癌中的表达及其对生存预后影响的分析

GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn,GEPIA database)是目前我国在利用TCGA数据做可视化分析上,比较著名的一款在线工具。打开数据库，在搜索栏中输入PKP3,在样本数据库中选择胰腺癌(PAAD),分析PKP3蛋白在胰腺癌组织、癌旁组织的表达差异，及其在不同临床分期胰腺癌组织中的表达水平。继续使用GEPIA 数据库深层次分析PKP3蛋白与胰腺癌患者的总生存期(overall survival,OS)及无疾病进展生存期(disease free survival,DFS)的关系。参照PKP3蛋白的表达水平的中位数,将数据库中的胰腺癌患者分为高表达组及低表达组,对两组患者进行生存预后分析。

1.2 观察PKP3蛋白在胰腺癌组织和正常胰腺组织中的表达差异

The Human Protein Atlas数据库(http://www.proteinatlas.org)是收集各地研究员在实验室中使用特殊的抗体，用免疫组化染色方法显示蛋白在不同组织中的表达图像，用来分析某种蛋白在肿瘤组织与癌旁组织表达的差异。本研究使用该数据库中的图像数据，观察PKP3表达差异。

1.3 PKP3蛋白相互作用网络及功能分析

应用String数据库(http://string-db.org/)与WebGestalt(http://www.webgestalt.org/)数据库分析与PKP3蛋白关系紧密的蛋白，记录排在前10的蛋白，绘制网状图及分析它们与PKP3蛋白的相互作用关系。

1.4 统计学方法

应用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。采用t检验验证胰腺癌组织和癌旁组织中PKP3的表达差异;利用F检验分析不同期别胰腺癌PKP3的表达;采用Kaplan-Meier法计算PKP3的表达水平与胰腺癌患者预后的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺癌组织与癌旁组织及不同期别胰腺癌组织中PKP3蛋白的表达比较

收集GEPIA数据库中的350例标本(179例胰腺癌组织标本及171例正常胰腺组织标本),经统计学方法整理分析后发现胰腺癌组织中PKP3蛋白表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01),如图1所示。更深入地分析不同病理期别胰腺癌组织中该基因的表达,发现病理分期Ⅰ～Ⅳ期胰腺癌组织中该基因表达差异并无统计学意义(HR=1.4,P=0.034),如图2所示。

图1 PKP3蛋白在胰腺癌组织和癌旁组织的表达情况

图2 不同分期胰腺癌组织中PKP3蛋白表达比较

2.2 胰腺癌中PKP3 蛋白表达与患者预后的关系

利用 GEPIA 数据中胰腺癌患者的生存数据进一步分析,以PKP3蛋白表达的中位数为标准,将数据库中胰腺癌患者分为PKP3 蛋白高表达组和低表达组,与低表达组比较,PKP3蛋白高表达患者OS明显缩短(HR=1.4,P=0.034),而DFS比较差异无统计学意义(HR=1,P=0.890),见图 3、4。

图3 PKP3蛋白表达与胰腺癌患者OS的关系

2.3 胰腺癌组织和正常胰腺组织中PKP3蛋白表达水平比较

基于The Human Protein Atlas 数据库分析胰腺癌

图4 PKP3 蛋白表达与胰腺癌患者DFS的关系

组织和癌旁组织中PKP3 蛋白分布情况。分析得出PKP3蛋白在癌旁组织与胰腺癌组织中均主要定位于囊泡和细胞膜,染色呈蓝紫色。但在胰腺癌组织中染色明显较深，如图5。

2.4 PKP3的生物信息学分析

在String 数据库中对与PKP3相关联的蛋白进行生物信息学分析,发现了10 个与PKP3在功能及定位上相关的蛋白,包括DSG1、DSG3、DSG4、DSC1、DSC2、DSC3、DSP、JUP、PPL、DSG2(图5),利用WebGestalt进一步对这些蛋白分析发现,这些蛋白主要构成细胞膜、囊泡等细胞结构。参与多细胞生物进程、细胞发展过程等过程,发挥结合蛋白质、结合离子等功能。

图5 PKP3功能及定位相关蛋白

3 讨论

Plakophilins(PKPs)蛋白家族包括PlakoF(PKPl)、Plakophilin 2(PKP2)及Plakophilin 3(PKP3)，同属于细胞黏附分子P120ctn家族，其共同特点为分子结构中具有特征性的Armadillo重复序列，具体为45个氨基酸，且与P120ctn该序列的相似50%。PlakophilinsmRNA主要存在于桥粒，对细胞桥粒的组成及功能维持有重要作用[3]。PKP3表达异常引起细胞黏连的缺失，继而导致肿瘤细胞处在高活性及高侵润性，使部分肿瘤细胞从原发肿瘤中分离，实现肿瘤转移。Aigner[4]与Papagerakis[5]完善实验证实PKP3的低表达与口腔癌及结肠癌的进展及转移有关。Li等[6]认为在鼻咽癌组织中，PKP3受miR-149的负向调节，与鼻咽癌的转移关系密切。但能否通过调整PKP3表达水平控制肿瘤转移暂无报道，仍需后期实验证实。 PKP3存在于细胞间桥粒组织中,是一种细胞间黏连蛋白,是细胞间黏连的主要组织,它与细胞桥粒的粘附构成了细胞间的连接[7]。现有研究证实在不同来源、不同组织病理学分期肿瘤组织与对应的癌旁组织之间的PKP3基因的表达模式存在差异,Papagerakis等[8]发现在口咽小细胞癌中,PKP3表达与肿瘤组织学分期呈负相关。Schwarz等[9]发现PKP3基因在肿瘤细胞中的表达明显高于正常胰腺组织,与本研究一致。综上所述,PKP3基因表达异常与肿瘤发生密切相关。 本课题研究178例胰腺癌患者总体预后时发现：高表达PKP3基因的胰腺癌患者总体生存时间、无进展生存时间明显缩短。有前期研究发现，在肺癌、胃癌、宫颈癌患者中，PKP3基因高表达明显降低患者生存时间[10-12]，与本研究一致。说明PKP3基因与肿瘤患者的生存时间密切相关。且有研究证实:PKP3的表达很有可能与淋巴结转移及肿瘤大小密切相关[13]。国外有报道通过调低PKP3表达后发现连接细胞桥粒体积缩小、细胞间粘附性下降，促进肿瘤细胞增长及转移[14]。而本研究结论提示高PKP3表达同样明显降低患者生存时间，推测原因可能因为：在肿瘤外因驱使下，细胞粘附蛋白排列紊乱，细胞桥粒体积过小，两者丧失粘附作用，导致肿瘤局部进展及转移。通过String及WebGestalt数据库对PKP3及相关蛋白分析显示,与PKP3蛋白相关的功能蛋白主要位于细胞膜、囊泡等膜性结构中,参与多细胞生物进程、细胞发展过程等过程,在结合蛋白、离子等过程中发挥着重要作用,但其具体功能有待进一步验证。

以往的实验研究方法一次仅能研究少数或几个基因,但随着测序技术的不断的改进和升级及基因组学和蛋白组学的大规模应用,产出的研究成果翻了几倍。如今的公共数据库整合了多项研究成果,利用当前的生物信息分析技术对公共数据库中的海量信息进行整合分析,更有利于从多个角度探索某个或某些基因与疾病的内在联系,为更深层次了解疾病打下基础。使用公共数据库进行初步分析，后期结合体外实验进行验证及扩展，已成为现如今科研新方向。

PKP3蛋白存在于生物体内几乎所有器官中，在不同肿瘤组织中表达水平各不相同，但其表达差异引起细胞间黏性改变，继而引起肿瘤进展及转移。本研究通过多个生物数据库得出结论：在胰腺癌组织中PKP3蛋白呈高表达,其表达水平与患者不良预后呈正相关,PKP3蛋白参与多种生物学过程,有希望成为胰腺癌诊断和治疗的新靶点,但其在胰腺癌发生发展中的具体功能有待进一步体内外实验探究。