腹泻患者肠道菌群特点及益生菌的干预研究

王慕华，麻杰，曹睿，彭晓光

（山西省生物研究院有限公司医药生物技术山西省重点实验室，太原 030006）

0 引言

人体肠道内存在着数量庞大、种类繁多、功能复杂的微生物[1]，其细胞数量为人体细胞的10倍以上，大约有2 kg[2]。在门水平上主要以拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门为主，在属水平上主要以拟杆菌属、普氏菌属、栖粪杆菌属、罗氏菌属、毛螺菌属、萨特菌属等为主[3-5]，参与着人体的多种代谢、免疫、内分泌调节等生理活动，从消化、营养吸收、能量供应、脂肪代谢、抗病等多方面影响着宿主的生理功能[6]。在正常状态下，肠道菌群之间相互制约、相互协调，共同维持着复杂而稳定的肠道微生物生态平衡；一旦这种平衡被打破，肠道菌群失调，益生菌数量减少，致病菌数量增加，各种与肠道菌群相关的疾病也便随之而来[7-9]。腹泻作为一种常见的肠道疾病，主要临床表现为排便量的增加，症状起因有许多种，多伴有肠道菌群的改变。一方面，肠道菌群的失调导致致病菌数量增加，致病菌通过侵袭力及毒素破坏正常的肠黏膜屏障，使得肠黏膜通透性增加[10]；另一方面，肠道菌群失调会使得炎症因子的表达及释放增加，肠道正常免疫平衡被打破，异常免疫反应被激活，从而导致肠道黏膜、组织损伤[11-12]。益生菌作为一种活菌微生态制剂，在维护肠道微生态平衡方面，起着不可忽视的作用[13]，一方面，益生菌通过黏附于小肠黏膜上皮细胞形成菌膜，同时促进肠上皮细胞分泌β防御素，构成一道肠道屏障，增强肠上皮细胞的自我保护及对受损的肠道屏障进行修复；另一方面，益生菌在肠道微环境中进行代谢活动，合成有益代谢物以及促进一些细胞因子的产生，从而抑制有害病原菌的生长繁殖[14-16]。本研究以腹泻人群为研究对象，在特定益生菌制剂的干预下，通过对腹泻患者粪便DNA提取，16S rDNA高通量测序，以及对腹泻患者的问卷调查，研究腹泻患者肠道菌群的变化和益生菌对腹泻症状的改善作用，为阐述腹泻与肠道菌群的关系提供科学数据，也为通过益生菌制剂以肠道菌群为靶点来调整、治疗腹泻提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 研究对象

健康人群为200例在体检中心进行一般体检的志愿者，其中男性105人，女性95人。所有志愿者要求身体健康，BMI指数为18.5～23.9，年龄在20～60周岁，通过问卷调查及体检信息确认无任何精神类疾病和肢体缺陷，并排除所有腹泻、肠炎、克罗恩病等肠道疾病，严重的传染病，免疫缺陷疾病以及心、肝、肾等主要脏器疾病，且近1个月内没有药物、抗生素、益生菌使用史，近1年内没有参与减肥项目、服用减肥药或做过减肥手术。

腹泻患者为长期慢性腹泻，有腹痛和消化不良的症状，大便不成形、有时会有黏液便或水样便。采样时有腹泻症状，近一个月没有服用任何药物治疗的人群。纳入研究的共20人，其中男性10人、女性10人，年龄40～60周岁，没有任何精神类疾病和肢体缺陷，并排除所有严重的传染病，免疫缺陷疾病以及心、肝、肾等主要脏器疾病。

1.2 实验益生菌

复合益生菌（固体饮料 活菌型），含乳双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌，活菌量为5×1012CFU/2 g，山西维尔生物乳制品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样本采集

纳入研究对象的人群自行采集无污染的新鲜粪便于粪便DNA样本保存管内，摇匀后可常温保存7 d，之后保存于-80℃冰箱，样本采集完成后一并提取样本DNA。

1.3.2 肠道菌群分析

肠道菌群分析采用16S rRNA基因高通量测序。具体方法为：提取样本DNA后，对合格的粪便DNA样本16S rRNA基因V3～V4区域进行PCR扩增、文库制备、文库质检、定量，使用设定的TAG序列进行样本区分。采用Illumina Hiseq 2500高通量测序平台对检测合格的文库进行测序。数据分析基于优化序列在97%的相似性下，利用QIIME[2]软件包中的Uclust方法进行OTU聚类分析，基于Silva参考数据库进行物种分类学（Taxonomy）注释。

1.3.3 益生菌干预

腹泻患者于每日晚饭后半小时服用复合益生菌加强A类I型，每日1次，每次2 g，连续服用30 d。取样时间为服用益生菌前1日和益生菌服用完成后的第2日。

1.3.4 腹泻的判断

每日排便3次或以上，且粪便性状异常，如稀便、水样便。大便性状判断采用布里斯托大便分类法（Bristol Stool Scale）：1型：一颗颗硬球，很难通过（评分1分）；2型：香肠状，但表面凹凸（评分2分）；3型：香肠状，但表面有裂痕（评分3分）；4型：像香肠或蛇一样，且表面很光滑（评分4分）；5型：断边光滑的柔软块状，容易通过（评分5分）；6型：粗边蓬松块，糊状大便（评分6分）；7型：水状，无固体块，完全液体（评分7分）。第1型和第2型表示有便秘；第3型和第4型是理想的便形，尤其第4型是最容易排便的形状；第5至第7型则代表可能有腹泻。

2 结果与讨论

2.1 腹泻患者肠道菌群分类

经过16S DNA V3～V4区测序、物种注释，20位腹泻患者的肠道菌群在门水平上大致可分为三类，第一类腹泻患者人群的肠道菌群多样性严重降低，变形杆菌占到肠道微生物总量的97%以上，为细菌感染性腹泻，分组命名为腹泻1，入组人数为10人；第二类腹泻患者人群的肠道菌群多样性变化不大，和健康人相比，厚壁菌丰度降低，梭杆菌丰度升高，分组命名为腹泻2，入组人数为6人；第三类腹泻患者人群的肠道菌群没有明显特征，互相都不类似，入组人数为4人，不作为研究对象。具体肠道菌群分布见图1，后续以腹泻1患者人群为研究对象进行益生菌干预研究。

图1 不同人群肠道菌群在门水平上的相对丰度

2.2 腹泻1患者人群的肠道菌群特点及益生菌的调节作用

2.2.1 腹泻1患者人群的肠道微生物多样性

在OUT水平上，健康人群的平均OUT数为393，腹泻1患者人群的平均OUT数为146，益生菌调节后腹泻1患者人群的平均OUT数为380，说明腹泻1患者人群的肠道微生物多样性明显低于健康人群，服用益生菌后肠道微生物多样性得到了改善。

2.2.2 腹泻1患者人群肠道菌群在门水平的主要变化

对腹泻1患者人群的肠道菌群与健康人群进行了比较，并研究了益生菌对腹泻1患者人群肠道菌群的调节作用，各不同人群以及腹泻1患者人群益生菌干预后的主要肠道菌在门水平上的相对丰度情况见表1、图2。

图2 不同样本肠道菌群在门水平上的分布

表1 不同样本主要肠道菌群在门水平上的相对丰度%

从表1及图2可见，健康人群肠道菌群在门水平上主要为厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门，所占丰度分别为47.16%、37.81%和10.02%，而腹泻1患者人群的肠道菌群在门水平上几乎全部变为变形菌门，占到肠道微生物总量的97.84%，拟杆菌门和厚壁菌门分别为1.47%和0.50%；其它在健康人群肠道菌群中丰度较高的放线菌门、疣微菌门在腹泻1患者人群中丰度降低，蓝藻菌门、梭杆菌门、黏胶球形菌门、Saccharibacteria、柔膜菌门在腹泻1患者人群的肠道菌群中没有出现。腹泻1患者人群的肠道菌群在益生菌干预后，变形菌门大幅降低，变为32.01%；厚壁菌门与健康人群基本相同，达到47.71%，拟杆菌门增加到12.89%；放线菌门与健康人群基本相同，疣微菌门超过健康人群，目前认为疣微菌门中的AKK菌是肠道中的一种有益菌。

2.2.3 腹泻1患者人群肠道菌群在属水平的主要变化

腹泻1患者人群的肠道菌群在属水平上与健康人群的比较以及益生菌对腹泻1患者人群肠道菌群的调节作用见表2、图3。

表2 不同样本主要肠道菌群在属水平上的相对丰度%

图3 不同样本肠道菌群在门水平上的分布

从表2及图3所示，健康人群肠道核心菌群中占主要地位的拟杆菌属、普氏菌属、粪杆菌属、毛螺菌属，在腹泻1患者人群肠道中大幅降低；健康人群肠道菌群中的小杆菌属、萨特氏菌属、副萨特氏菌属、巨单胞菌、Rikenellaceae-Alistipes在腹泻1患者人群肠道中消失，腹泻1患者人群的微生物多样性降低；致病菌志贺氏杆菌和克雷伯氏杆菌属占到了腹泻1患者人群肠道微生物总菌数的86.63%，这两种菌是引起腹泻的主要原因。益生菌干预后腹泻1患者人群的肠道菌群中拟杆菌属、普氏菌属、粪杆菌属、毛螺菌属的相对丰度都有回升，粪杆菌属、毛螺菌属基本达到健康人群标准；一些益生菌干预前消失的微生物都有不同程度的回升，微生物多样性增加；致病菌志贺氏杆菌降低，达到了健康人群的水平，克雷伯氏杆菌属有降低，但仍大大高于健康人水平；通过益生菌干预，对人体有益的罗斯氏菌属、Verrucomicrobiaceae-Akkermansia相对分度大于健康人平均水平。

2.2.4 主要变化菌群分析

分析腹泻1患者人群的肠道菌群与健康人群的差异，并比较益生菌干预前后腹泻1患者肠道菌群的变化，以及恢复后是否达到了健康人群肠道菌群核心菌的丰度和微生物多样性，具体差异情况见图4。

图4 肠道菌群差异分析

从图4可以更清晰的看到，健康人群以拟杆菌属、粪杆菌属、普氏菌属、毛螺菌属、Lachnoclostridium、双歧杆菌属、副萨特氏菌属等作为主要肠道核心菌属，腹泻1患者人群肠道菌群被破坏，主要以志贺氏杆菌、克雷伯氏杆菌属为主，益生菌干预后腹泻1患者人群肠道微生物多样性增加，基本达到健康人群水平。

2.3 益生菌对腹泻1患者腹泻症状的改善作用

2.3.1 每日大便频次

对所有腹泻1患者在益生菌干预的过程中，每周进行日大便次数的统计，取每周的日平均大便次数作图，益生菌干预的4周内，腹泻1患者人群的大便频次情况见图5。

图5 益生菌干预过程中患者大便频次的变化

从图5所示，腹泻1患者的平均日大便次数在益生菌干预前可达4.8次/日，益生菌干预1周后为2.6次/日，益生菌干预2周后为1.4次/日，益生菌干预3周后为0.9次/日，益生菌干预4周后为1次/日。益生菌干预后，所有腹泻1患者的大便次数基本恢复到正常水平。

2.3.2 粪便性状评分

对所有腹泻1患者在益生菌干预的过程中，每周进行大便性状评分的统计，取每周的日平均粪便性状评分作图，益生菌干预的4周内，腹泻1患者人群的粪便性状评分情况见图6。

图6 益生菌干预过程中患者粪便性状的变化

从图6所示，腹泻1患者的平均粪便性状评分在益生菌干预前可达6.3，具有明显腹泻症状；服用益生菌1周后，平均粪便性状评分为5.2，仍有腹泻症状，但症状减轻；服用2周后，平均粪便性状评分为4.5，基本达到正常水平；服用3周后平均粪便性状评分为3.9，服用4周后平均粪便性状评分为4.0，达到理想的便形。

2.3.3 自我疗效评判

对服用益生菌后肠道菌群和腹泻症状都明显改善的10名腹泻1患者进行自我疗效感觉、腹痛、精神状态方面的随访，患者自我感觉情况见表3。

表3 腹泻1患者服用益生菌后的自我疗效评判

从表3中可见，服用益生菌对所有腹泻1型患者都有明显的疗效，由腹泻引起的腹痛减轻和消除，精神状态变好。

3 结论

腹泻的原因较多，肠道菌群的改变也不相同，对变形菌增加的这类细菌感染引起的腹泻患者来讲，肠道菌群变化是引起腹泻的主要原因；益生菌对这类患者的肠道菌群有很好的调节作用，可以帮助患者增加肠道微生物多样性，降低致病菌丰度，从而改善、消除腹泻症状；服用益生菌并不是提高肠道中所服用的菌株的丰度，而是通过调节肠道菌群，使患者恢复正常的肠道微生态结构，从而恢复正常的生理机能；要想系统地阐明腹泻与肠道菌群的关系以及益生菌的干预作用，应该加大样本量，分类干预，使研究结果更具有代表性，但对细菌感染引起的腹泻，本研究能够说明一定的问题，对肠道菌群与腹泻关系的研究有一定的借鉴作用，也可为细菌感染的腹泻患者减少抗生素的使用，通过益生菌调节肠道菌群，恢复健康提供依据。