乳铁蛋白的开发制备及在婴儿配方奶粉中的应用

肖明，李春，杨玉琢，刘春波，李春梅

（黑龙江省绿色食品科学研究院，哈尔滨 150028）

0 引言

母乳是婴儿重要的营养来源，乳铁蛋白(lactoferrin，LF)作为母乳中的活性成分，在铁离子转运、存储及促进红细胞增殖等方面均发挥作用，对于婴儿免疫力的提升和营养结构的改善也具有重要意义[1]。当母乳不足或其他因素导致婴儿无法从母乳中摄取足够营养时，婴儿配方奶粉是母乳之外的最优选择，因此LF在婴儿配方奶粉中有效合理的应用既能满足婴儿生长发育的需要，又能保护婴儿的健康，满足了非母乳喂养婴儿的营养需求。

LF是从牛乳中提取的天然物质，国外产业化技术发展较为成熟。LF的商业化生产始于1985年，由比利时的Olefina公司生产。1989年，德国米雷有限公司和日本森永乳业株式会社成立了一家合资企业，实现了LF的大规模生产[2]。自20世纪90年代以来，数量有限(全球不到10家)的乳制品制造商定期生产LF。而国内对LF产业化研究较少而且还没有产业化，LF生产的核心技术被国外企业掌握且我国原料奶价格高，所以我国所需的LF都依赖进口，荷兰、澳大利亚等国的乳品企业因此快速占领了我国市场[3]。为了解决这些问题，需要对LF提取纯化的产业化技术进行研究，开发经济高效的LF生产方法。本文对LF的相关特性、开发及其在婴儿配方奶粉中的应用进行了总结，以期推动LF的工业化生产。

1 LF的特性

1.1 LF的分布与含量

LF是分子量在77～80 ku之间的铁结合糖蛋白[4]。LF由哺乳动物的乳腺上皮细胞分泌，在乳汁中含量丰富。人乳的LF含量最高，约为1.0～3.0 mg/mL，牛乳的LF含量只有人乳的十分之一。在泌乳期的不同时间段，LF含量也不同，初乳中LF的含量较高，而在乳汁成熟期的中后期则较低[5]。如人初乳中LF高达7 mg/mL，早期乳为5 mg/mL，常乳期为2 mg/mL。牛初乳中的LF含量在0.8 mg/mL以上，24 h后为0.42 mg/mL，牛常乳中是0.2 mg/mL[6-7]。此外，LF广泛存在于哺乳动物的外分泌液和组织液中，如羊水、小肠分泌液、精液、关节液、泪液等[8]。血液中也含有LF，主要由中性粒细胞分泌，子宫内膜、唾液腺及骨髓等也能分泌少量LF[9]。

1.2 LF的组成和结构

LF由一条多肽链和两条糖链组成[10]，多肽链的一级结构约含700个氨基酸[11]，氨基酸序列因种属来源不同而有所差别，同源性约为70%[12]。LF含有较多的赖氨酸和精氨酸，是碱性蛋白质[13]。LF在低于其等电点（pI=8.9）的pH环境下带正电，能够结合带负电的蛋白质形成超分子结构，这也是其发挥多重生物学功能的原因之一[14]。LF的二级结构由沿着氨基酸序列交替排布的α-螺旋和β-折叠构成[15]。LF呈图1所示的结构[18]，由两个球形的羧基(C)和氨基(N)末端叶组成，两叶通过一个三圈螺旋相连，由C1，C2，N1和N2结构域组成，它们与两个CO32-一起负责Fe3+的结合，且具有较高的铁亲和力（Kd=10-20M）[16]。LF可以在铁饱和LF(Holo-lactoferrin)和脱铁LF(Apo-lactoferrin)两种构象状态之间切换，且前者比后者更稳定[17]。

图1 LF二级结构示意图[18]

在人LF中发现3个潜在的糖基化位点(Asn 138、Asn 479和Asn 624)，在牛LF中发现5个潜在的糖基化位点(Asn 233、Asn 281、Asn 368、Asn 476和Asn 545)如图2所示[19]。LF通过N型糖基化与糖（主要是高甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖）结合。N型糖基化位点的数量和与LF相连的糖的类型受基因表达的精确调控，而LF对热变性和蛋白水解的敏感性受糖基化位点变化的影响[8]，这些位点大多暴露在分子的外表面，可能参与特异性受体的识别[20]。

图2 LF的预测结构及其潜在的糖基化位点图[19]

2 牛乳LF的制备与开发

2.1 色谱法

2.1.1 离子交换色谱

对于离子交换色谱，介质的选择是根据它们的阳离子交换强度或容量、离子特异性、机械阻力以及清洁和再生的化学稳定性来进行的。总体而言，阳离子交换层析过程可以去除牛奶或乳清中高达95%的不需要的固体[21]。刘佳欣等人[22]用阳离子交换色谱法分离牛初乳中LF，最佳分离条件为起始缓冲液pH=7.03，洗脱速度1.01 mL/min，洗脱液浓度1.01 mol/mL，上样速度0.82 mL/min，对应的LF的得率为84.43%。Teepakorn等[23]利用阳离子交换色谱对LF进行了分离。LF结合在阳离子交换膜上的动态结合容量为10%，约为60 mg。在阴离子交换膜上，用pH6.0的5 mmol/L磷酸盐缓冲液，在流量为287.46 gm-2/h的条件下收集水中的LF。此外，用Sarabind S75柱子进行了完整的分离循环，处理时间短，为34.19 min，LF生产率超过2628.84 mg/h。Huppertz等[24]通过离子交换层析分离LF。阳离子交换树脂可以将LF和乳过氧化物酶一起捕获。随后可通过盐梯度或pH梯度洗脱树脂实现LF和乳过氧化物酶的分离，可以制备高纯度(>95%)的乳铁蛋白。离子交换色谱法操作简单，方便快捷，准确可靠，重现性好，此法的缺点是LF和乳过氧化物酶会被一起捕获，所以对于此方法的研究重点是洗脱条件的确定。目前该方法在婴儿配方奶粉和专业营养领域的其他产品中都得到了广泛的应用。

2.1.2 亲和色谱

亲和色谱是利用固定相的结合特性来吸附靶蛋白。Jayaprakash等[25]采用不含氯化钠结合缓冲液的MEP树脂柱进行亲和层析，乳铁蛋白的回收率最高达91%，纯度提高2.9倍。因此，MEP HyperCelTM亲和层析有可能成为从牛初乳乳清中分离LF的一种潜在的替代方法。Ng等人[26]确定了适用于使用羟基磷灰石从乳清中纯化LF的色谱条件并成功去除乳过氧化物酶。研究表明，80 L羟基磷灰石柱每小时可产生0.32 kg LF。Carvalho等人[27]的研究使用载有Cu2+（与亚氨基二乙酸(IDA)结合）的聚丙烯酰胺冷冻凝胶作为色谱过程的吸附剂来捕获LF。超滤奶酪乳清通过cryogel-IDA-Cu系统并捕获高纯度的LF。总的来说，利用树脂柱进行的亲和层析的回收率较高，纯度较低，这可能是由于柱子的结合特性不够好，后续可以加大对于柱子筛选的研究，也可以将树脂柱亲和层析与其他分离技术结合使用。利用羟基磷灰石或载有Cu2+的吸附剂进行的亲和色谱消除了由于分子量和等电特性的相似性导致的乳过氧化物酶共同纯化的影响，该过程具有高吞吐量和低成本的优点，这使得其应用于LF的工业化生产成为可能。

2.1.3 膨胀床色谱

膨胀床色谱技术是一种生物分离技术。Rm等人[28]为了使吸附剂在亲和色谱的膨胀床中正常工作，以活性蓝4作染料配体来支持吸附剂。研究首先使用三相乳液法制备了双层琼脂糖-镍@活性蓝4复合物，然后吸附LF纳米粒子，LF纳米粒的回收率约为83%。Du等人[29]使用Fastline SP作为阳离子交换剂进行膨胀床色谱并优化了洗脱条件。结果表明，Fastline SP对LF的吸附速度较快，适合高速操作。在pH7.0的磷酸盐缓冲液中，洗脱条件优化为0.5 mol/L NaCl，最后成功回收乳铁蛋白，纯度为88.5%，回收率为77.1%。膨胀床色谱法的重点是吸附剂的选择及洗脱条件的确定。此法可以直接从粗原料或黏性溶液中捕获靶蛋白，具有分离效率高、处理量大、运行成本低、可连续操作等特点，是可用于LF工业化分离纯化的新型技术，具有广阔的应用前景。

2.2 萃取法

基于镧系元素和Fe3+在电荷和离子半径上具有一定的相似性，Fan等人[30]设计了一种“除铁-还原”固相萃取法，用于从复杂基质中选择性萃取LF。Tb3+在IDA改性的二氧化硅上官能化，得到Tb@SiO2微球，被用作LF萃取的高效吸附剂，SDS-PAGE结果表明获得了高纯度的LF。Pawar[31]等人利用CTAB/正庚醇组成的反胶团体系从乳清蛋白溶液中选择性提取LF。通过研究NaCl浓度和水相pH对LF向胶束相分配的影响，改进了LF的选择性萃取工艺。在水相pH为10.3、NaCl浓度为1.1 mol/L时，LF从酸性乳清到胶束相的萃取率最高(98.7%)，此时LF以94%的提取效率和100%的纯度被反萃取到水相反萃取相中。Pawar等人[32]还研究了在pH=10的正庚醇中，加入1 mol/L NaCl，用50 mmol/L CTAB形成的阳离子反胶束萃取LF合成液中的LF，使蛋白质100%被包埋在胶束相中。在添加剂(7%正丙醇或正丁醇)和电解质(1.3 mol/L KCl)存在下以及pH为6的条件下，98%的LF被反萃取到水相中。总的来说，固相萃取要选择获取简便且高效的吸附剂，如二氧化硅微球上镧系元素的修饰简单方便、吸附效率高，这可能有助于LF提取工艺在工业上的应用。水相反萃取后有机相的回收表明其可以循环使用，且该方法省去了乳清的预处理步骤，因此该工艺更经济在工业上规模化生产是可行的。

2.3 多种方法结合分离

2.3.1 超滤结合离子交换色谱法

Maciel等人[33]提出了一种将LF分离纯化的两种操作相结合的简单方法。乳清蛋白经微滤澄清，再经超滤和透析过滤，使LF的浓缩和预纯化达到1.1 mg/mL，然后用阳离子交换膨胀床色谱法对蛋白进行纯化。所得LF的纯度为92.7%，回收率为87.0%。马闯等人[34]采用超滤膜分离及离子交换色谱技术相结合的方法分离纯化LF。首先乳清经两次膜过滤，截留50～200 ku的组分，然后通过离子交换层析进一步纯化，最终LF得率在80%以上。Rong等人[35]通过超滤从牛初乳中分离LF，然后用阳离子交换对LF溶液进行色谱分离，所得LF的纯度和回收率分别为94.20%和82.46%，再经过脱盐浓缩及冷冻干燥，获得LF精制品。LF热稳定性很差，而超滤膜分离是一个无需加热的物理分离过程，可以最大限度的保持LF的生物活性。此外，采用-35～-40℃的升华温度、47 Pa的真空度作为干燥条件，能较好的保留蛋白的营养和保证产品的复水性能，利于LF的再利用[36]。超滤结合离子交换色谱法所获得的LF的纯度和回收率都较高，此方法成本适中，产品纯度高，适合规模化生产。

2.3.2 盐析结合凝胶层析法

徐丽萍等[36]采用超滤、盐析和凝胶层析相结合的方法进行LF分离纯化：使用醋酸纤维素膜对乳清进行两次超滤和一次浓缩，然后用50%硫酸铵除去杂蛋白，再用80%硫酸铵盐析，最后用CM-Sephadex G-100进行层析得到纯度为92%的LF。此外，曲练达等[37]采用3次盐析和1次凝胶层析相结合的方法从牛初乳中分离纯化得到纯度为92%的LF。盐析结合凝胶层析法研究所获得的LF纯度较高，但都未提及回收率，而在LF的工业生产中，回收率也是一个重要指标，为使此方法工业化，其回收率的研究是日后的工作方向。

3 LF在婴儿配方奶粉中的应用

《乳铁蛋白人群健康效应专家共识》指出LF可以改善婴幼儿营养状况，降低婴幼儿肠道疾病、呼吸道疾病、缺铁性贫血等的发病风险[38]。目前，LF已作为一种食品添加剂用于婴儿配方奶粉中。国外婴儿配方奶粉中LF的添加量在0.5 mg/g左右，我国卫生部在国家标准GB14880-2012中批准LF在婴儿配方奶粉中的添加量为≤1.0 g/kg[39]。LF具有多种生物学功能，可作为药物和营养成分用于临床[40]。LF会因其营养活性的不可替代性而一直受到乳制品市场的关注。

3.1 LF婴儿配方奶粉的制备

目前，市售婴儿配方奶粉都是理化指标符合标准，即在宏观量上接近母乳。但是在功能性上还与母乳存在较大的差别。向婴儿配方奶粉中添加LF，可以促进配方奶粉的“母乳化”。

赵红霞[41]参考国家标准GB14880-2012和国外品牌婴儿配方奶粉中LF的添加量，并考虑母乳化程度及成本等几方面设计配方，设定婴儿配方奶粉中LF的添加量为50 mg/100 g。生产时将基粉半成品和依据配方称重的LF、DHA、ARA等在预混机中预混，然后在干混机中干混，即得到添加LF的婴儿配方奶粉。产品检测指标符合GB 10765-2010的要求，证明添加LF对婴儿配方奶粉的品质无不良影响，且产品在功能特性上进一步接近母乳。

也有研究指出了新的思路，美国和一些欧洲国家市场上售有液体即食婴儿配方乳。配方乳经超高温灭菌处理确保安全，但LF等营养物质大量流失。因此，Wazed[42]等人为了比较不同灭菌方式对配方乳中LF保留率的影响，将100 mg LF添加到100 mL复溶的婴儿配方粉中，然后采用巴氏灭菌和超高温灭菌处理婴儿配方乳。研究表明在温度为70.8℃、时间为42 s；温度为71℃、时间为57 s时，LF保留率分别为94.6%和91.9%，而超高温灭菌处理的LF保留率仅为66%～83%。此外，经巴氏灭菌后，LF明显保持了铁的结合能力和贮存稳定性，这证实了巴氏灭菌技术在LF婴儿配方乳中的应用前景。相比于进过喷雾干燥的配方奶粉，液体即食婴儿配方乳的营养保留更多，随着生产技术的提高和人们认识的提升，未来配方乳替代配方粉会成为可能。

3.2 LF婴儿配方奶粉对婴儿健康的影响

为明确LF对婴儿健康的影响，国内外多名学者针对新生儿发病率较高的败血症、肠炎、缺铁性贫血、呼吸道感染等疾病通过对婴儿喂食LF强化婴儿配方奶粉或口服和肠内补充LF进行了相关研究。

新生儿败血症是因细菌通过血液循环进入新生儿全身并产生毒素，致使新生儿多血管功能及心肌损伤并可能危及患儿生命[43]。Cornette等[44]对472名低出生体重儿进行研究，发现出生体质量＜1 500 g的新生儿口服LF治疗组迟发性败血症发生率为5.9%，显著低于未口服组的17.3%；对出生体质量＜1 000 g的新生儿效果更显著，口服LF治疗组迟发性败血症发生率为0%，显著低于未口服组的4.8%。可见LF在新生儿败血症中具有预防作用。Cochrane做了6个随机对照实验，以明确肠内补充LF对预防迟发性新生儿败血症的效果。结果表明当肠内补充LF时，即使不添加益生菌早产儿迟发性败血症也显著减少[45]。Ochoa等[46]的研究也表明，母乳中的LF可有效预防新生儿迟发性败血症。

LF可以通过调节肠道的通透性和营养状态加速肠上皮细胞的成熟[47]。Wulff等[48]对早产或低体重儿坏死性小肠结肠炎的发生率与其食用LF婴儿配方奶粉的关联性进行了研究。结果显示给予LF 200 mg/d的干预组未发生坏死性小肠结肠炎，而给予生理盐水2 mL的对照组发生5例坏死性小肠结肠炎。还有研究给婴儿喂食LF婴儿配方奶粉进行实验，结果表明婴儿肠道菌群得到调节，粪便中溶菌酶活性、双歧杆菌和有机酸含量均呈现增加趋势[49]。

婴儿吸收LF的同时，其胃肠道会吸收大量的铁，促进了母乳中铁元素的吸收，所以母乳喂养的婴儿很少缺铁[50]。由此推测LF婴儿配方奶粉也可达到促进铁吸收的目的。柴灵莺等[51]的研究表明，喂食LF婴儿配方奶粉的婴儿缺铁性贫血和铁缺乏检出率明显下降且其外周血红蛋白和血清铁蛋白水平明显升高。这个结果与Paesano等[52]的研究结果相近。此外，陈冠仪等[53]的研究也表明，给新生儿喂食强化LF配方奶粉可提高红细胞的压积比、平均体积等指标。

King等[54]开展的摄入不同含量LF的婴儿配方奶粉对下呼吸道感染发作频率影响的实验发现，摄入含850 mg/L LF的实验组下呼吸道感染的发作频率显著低于摄入含102 mg/L LF的对照组。Chen等[55]的实验也显示，婴儿食用LF强化配方奶粉后呼吸道相关疾病发生率显著低于对照组。还有研究发现，婴儿食用添加牛乳脂肪球膜和LF的婴儿配方奶粉后，神经元发育加快、语言得到改善，且腹泻和与呼吸相关的疾病明显减少[56]。

以上研究结果表明，LF可以预防婴儿败血症、肠炎、缺铁性贫血和呼吸道感染的发生，对婴儿的健康有促进作用。但上述研究对于健康影响机制的研究比较少，以后可以加大这方面的研究力度。此外，后续的研究还可以围绕LF在婴儿配方奶粉中的最适添加量来进行。添加牛乳脂肪球膜和LF的婴儿配方奶粉对于婴儿健康状况的改善也为以后的研究提供了新的方向，可以将与LF具有协同作用的活性物质一起加入到婴儿配方奶粉中，使其成分进一步接近母乳，更好的满足婴儿的营养需要。

4 展望

通过将基粉半成品和LF预混、干混，可得到LF婴儿配方奶粉，且LF婴儿配方奶粉能够降低婴儿肠道疾病、呼吸道疾病、新生儿败血症、缺铁性贫血等疾病的发病风险；虽然色谱法、萃取法、超滤结合离子交换色谱法、盐析结合凝胶层析法等为LF的工业化生产提供了可能，但是大规模、低成本、高回收率的分离纯化技术仍是制约LF应用的瓶颈。未来应该在以下方面对牛乳LF开展进一步研究：多种技术相结合，开发更高效率，低成本的工业生产方法以获取LF；对LF婴儿配方奶粉进行更多的安全性和耐受性评价，提供LF的确切添加量；对与LF具有协同作用的活性物质和LF在婴儿配方奶粉中的共同添加进行研究。未来我国从牛乳中分离纯化LF技术的产业化势在必行，添加LF的婴儿配方奶粉的研发将对改善国产婴儿配方奶粉的功能起到重要作用，LF婴儿配方奶粉投放市场必将具有深远的意义。