铁皮枫斗颗粒对慢性萎缩性胃炎伴上皮内瘤变大鼠的逆转作用及其机制研究*

任泽明 陈思思 陈 璇 童晔玲 戴关海 薛晓敏 吴人照

浙江省中医药研究院 浙江 杭州 310007

铁皮枫斗颗粒（简称GD）由铁皮石斛和西洋参组方而成，中医学文献记载石斛具有“厚肠胃”“平胃气”“养胃生津”等功效，西洋参可益气滋阴，所以铁皮枫斗颗粒既往已批准的主要功能为益气养阴、养胃生津。因此，该药是气阴两虚证型慢性萎缩性胃炎（CAG）的有效药物。前期我们一些研究提示，该药对CAG有一定的疗效[1,2]。为了进一步研究其对CAG及其并发症（上皮内瘤变和肠化）的治疗效果，以及可能的机制，更好地利用该药物提供科学依据，开展了下述研究。

1 实验材料

1.1 动物：Wistar大鼠：12周龄，体质量（180±20）g，均为雌性，SPF级。购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006，合格证号：1100111911044265；动物饲养于浙江省中医药研究院实验动物中心，许可证号：SYXK（浙2019-0010）。

1.2 药物：铁皮枫斗颗粒（浙江天皇药业有限公司提供）。

2 实验方法

2.1 造模及分组：以12周龄Wistar大鼠70只，15只为正常组，其余55只，采用综合法造模：采用同品系大鼠胃黏膜添加弗氏佐剂（m：v=1∶1），制备胃黏膜细胞悬液，腹部皮下注射0.5mL/只，两周后再次注射。然后经口给予60%的酒精溶液，1mL/只，间隔1个月，再给予1次。在此期间，配制20%的酒精溶液放在水瓶中供自由饮用。取模型组大鼠两只，对照组两只处死，做胃组织病理检查，观察成模情况。根据病理结果，改成亚硝基胍水溶液167μg/mL放入避光的水瓶自由饮用继续造模，1个月后，再次取模型组大鼠3只，对照组3只，做病理检查，观察到基本成模后，将造模的动物，随机分成高、中、低3个剂量组，另设模型组及正常组作为对照，开始给予治疗，同时亚硝基胍水溶液继续饮用。治疗周期为3个月。

2.2 指标检测：实验结束，腹腔注射麻醉大鼠，解剖取材，标本为全胃，上段留0.5cm食管，下段留1.5cm十二指肠，沿胃大弯剪开，一半用大头针、塑料泡沫板固定，浸于10%甲醛溶液中。委托浙江中医药大学做病理检查，分别做HE染色和AB染色。扫描病理切片，观察胃黏膜炎症情况、腺体厚度、腺体数目、上皮内瘤变、肠化生、壁细胞和主细胞数目等项目。另一半冻存，采用全自动蛋白定量检测系统对目标蛋白烯酯酰辅酶A水合酶1（Ech1）、Bcl-2相关X（Bax）及B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）进行定量检测。

2.3 病理阅片：①胃黏膜炎症情况：用半定量法，即在低倍镜下观察整个胃黏膜，然后在胃窦部取10个视野，参照1994年美国休斯敦提出的胃炎诊断标准，按炎症细胞浸润的程度分为0～3 7个级别。②胃黏膜腺体厚度：每张切片取胃窦部黏膜5个视野，用测微器测出每个视野的胃窦黏膜腺体厚度，得出每张切片5个视野的平均值（μm）。③胃腺体数目：100倍镜下，找到每只大鼠的幽门环0.2～1.2mm（200～1200μm）之间（即1mm范围）胃窦固有腺体总个数，单位以“个/mm”表示。④上皮内瘤变：每张切片取5个高倍镜视野观察胃黏膜上皮细胞有无细胞核多形性，腺体不典型增生（采用轻、中、重级别报告）。⑤壁细胞、主细胞数目：400倍镜下，每张切片取前胃和胃体部交界以下1.0mm开始的胃体部黏膜5个视野平均值。⑥肠上皮化生表现：AB染色，观察胃黏膜的肠化情况（杯状细胞等）。每个动物胃黏膜病理切片经滨松数字切片扫描系统扫描后，在100倍放大截取3张胃窦部黏膜照片，照片分辨率1920×1216，实际物理尺寸：1.70mm×1.06mm，各组在相同条件下操作。采用ImagePro Plus 6.0（IPP6.0）图像分析系统分析，各组以相同条件下选取每张照片的阳性总面积、平均光密度、总光密度，进行组间统计比较。

3 统计学方法

采用SPSS21.0软件进行统计，计量资料以均数±标准差（xˉ±s）表示，多组均数比较，先进行方差齐性检验后采用方差分析，若差异有显著性，进一步两两比较，若方差不齐，采用Dunnett T3检验，P＜0.05差异具有统计学意义。对于计数资料，根据不同等级进行赋值，转化成计量资料进行分析。

4 结果

4.1 铁皮枫斗颗粒对大鼠体质量及相关脏器的影响：经统计，与正常组比较，模型组在初始体质量、终末体质量及肝脏湿重上有显著差异（P＜0.05），在胃组织重量有所降低，但差异未见显著差异。上述差异可能是因为造模引起。除正常组外，其他各组与模型组相比，均未见显著差异。见表1。

表1 铁皮枫斗颗粒对大鼠体重及脏器的影响（±s，g）

表1 铁皮枫斗颗粒对大鼠体重及脏器的影响（±s，g）

注：与正常组比较，*P＜0.05。

组别高剂量组中剂量组低剂量组模型组正常组胃9.36±1.48 8.66±1.69 7.58±0.95 8.19±1.71 8.58±1.18样本数（只）10 10 10 10 10初始体质量281.35±16.19 276.86±17.25 280.95±20.79 282.05±15.53*301.43±16.91终末体质量310.58±27.33 317.91±32.66 305.94±22.81 310.24±25.11*344.46±19.30肝脏2.26±0.30 2.19±0.22 2.05±0.23 2.14±0.20*2.49±0.18

4.2 铁皮枫斗颗粒对大鼠胃组织病理的影响：经统计，与正常组比较，模型组在炎症等级、腺体数量及腺体厚度上有显著性差异（P＜0.05），主细胞和壁细胞数量有所降低，可能因变异过大，差异未见显著性。与模型组相比，各剂量组在炎症等级、腺体数量及腺体厚度上明显好转，效果显著。主细胞和壁细胞数量有所增加，向正常靠近，但因组内变异较大，效果不显著，但可见改善的趋势。见表2。

表2 铁皮枫斗颗粒对大鼠胃组织病理的影响（±s）

表2 铁皮枫斗颗粒对大鼠胃组织病理的影响（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别高剂量组中剂量组低剂量组模型组正常组壁细胞（个）585.40±97.13 556.50±65.88 542.5±23.22 506.40±62.83 568.00±84.49样本数（只）10 10 10 10 10炎症等级0.40±0.39#0.35±0.41#0.30±0.26#1.50±0.33*0.10±0.21腺体数量（个/mm）55.80±4.85#56.60±2.01#55.70±2.90#48.20±1.75*57.40±2.59腺体厚度（μm）287.82±23.44#274.26±37.71#267.46±35.14#231.04±17.44*296.22±21.86主细胞（个）527.60±145.82 441.00±107.75 477.00±39.07 450.20±102.10 528.90±122.82

4.3 铁皮枫斗颗粒对大鼠胃组织上皮内瘤变及肠化的影响：经统计，与正常组比较，模型组在上皮内瘤变和肠化方面（肠化阳性面积、灰度值和总光密度）均有显著性差异（P＜0.05）；与模型组相比，各剂量组在上皮内瘤变、肠化面积及灰度值均有改善，但无显著性差异。见表3。

表3 铁皮枫斗颗粒对大鼠胃组织上皮内瘤变及肠化的影响（±s）

表3 铁皮枫斗颗粒对大鼠胃组织上皮内瘤变及肠化的影响（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别高剂量组中剂量组低剂量组模型组正常组总光密度2308569.33±956373.71 3509121.25±1089716.96 5934910.68±1945244.80 5198760.39±3351544.50*2390027.39±1900571.69样本数（只）10 10 10 10 10上皮内瘤变情况0.40±0.52 0.30±0.48 0.50±0.71 0.60±0.51*0.00±0.00肠化阳性面积（μm2）12175.40±5100.42 18739.60±6070.13 30841.70±9896.05 26516.00±17074.58*12488.80±9796.26灰度值201.48±1.97#198.90±3.82#203.17±2.91 205.92±3.18*200.72±3.98

4.4 铁皮枫斗颗粒对大鼠胃组织中Ech1、Bax及Bcl-2表达的影响：经过统计分析，与模型组相比，Bax和Ech1蛋白表达水平在高剂量组显著升高（P＜0.05），在其他剂量组表达也有增加，但是差异不显著。Bcl-2各剂量组未见显著差异，但表达有增加的趋势。见图1。

图1 铁皮枫斗颗粒对大鼠胃组织中Ech1、Bax及Bcl-2表达的影响

5 讨论

我国新近调查表明，胃癌发病人数和死亡例数均约占世界的一半，疾病负担严重，是癌症防治的重点[3]。治疗或者逆转胃癌前病变，对于防治胃癌，减轻疾病负担，意义重大。CAG常伴随肠化生、上皮内瘤变等癌前病变[4]。上皮内瘤变也称为不典型增生，异型增生，2000年后，国际上逐渐统一，便于临床分类与治疗[5]。上皮内瘤进一步发展即是胃癌[6]。改善或者逆转这些改变，成为治疗慢性萎缩性胃炎，防治胃癌的关键策略。

本研究从改善或逆转这些不良改变入手，观察铁皮枫斗颗粒对慢性萎缩性胃炎及其并发症的治疗效果及可能作用机制。通过研究发现，铁皮枫斗颗粒能够显著减轻慢性萎缩性胃炎的炎症情况，并能够促进腺体状态的恢复。对于主细胞和壁细胞数量上也有一定的好转，这与我们前期相关研究结果相似[2]，该研究提示损伤胃黏膜在铁皮枫斗颗粒治疗下，萎缩得到明显恢复，分泌功能也得到一定程度的改善。本研究还发现铁皮枫斗颗粒对大鼠胃组织慢性萎缩性伴上皮内瘤变和（或）肠化生均有一定的减轻缓解作用，各治疗组大鼠胃组织上皮内瘤变及肠化情况向正常方向逆转。

烯酯酰辅酶A水合酶1（enoyl coenzyme A hydratase 1，Ech1）是一种具有烯酰辅酶水合酶活性的蛋白质，是脂肪酸β氧化的关键酶[7]。Ech1表达异常与胃癌等肿瘤密切相关，有研究发现Ech1在胃癌中下调[8]。故本研究对慢性萎缩性胃炎及其并发症胃黏膜组织中Ech1蛋白表达水平进行了检测。结果发现，模型组动物Ech1与正常组相比，显著降低，经过给药，该蛋白表达水平有所回升，其中，高剂量组显著上升，接近正常组水平。这说明铁皮枫斗颗粒可能通过上调Ech1起到逆转慢性萎缩性胃炎伴上皮内瘤变的作用。

Bax和Bcl-2是两个具有代表性的细胞凋亡相关基因，目前认为，这两种基因的比例决定细胞的凋亡程度[9]。本研究发现，铁皮枫斗颗粒能够上调这两种蛋白的表达水平，改变这两种蛋白的比例情况，通过调节胃黏膜细胞的凋亡来改善慢性萎缩的症状，抑制萎缩的进展，进而逆转慢性萎缩性胃炎及其并发症。

该研究表明，铁皮枫斗颗粒对治疗慢性萎缩性胃炎有较好的治疗作用，同时对于萎缩性胃炎伴随的上皮内瘤变及肠化也有一定的逆转作用，这可能是通过对Ech1调节起作用，这为慢性萎缩性胃炎伴随并发症的治疗提供了新的思路。