冠心宁片改善大鼠心肌细胞焦亡机制探究

施佳君 杨钦钦 富丹婷 郑纯威 黄 强 陈 宇

浙江省中医药研究院 浙江 杭州 310007

心力衰竭（heart failure，HF）是各种心脏疾病的终末阶段，具有发病率高，死亡率高的特点。心衰的产生受多种因素影响，蒽环类抗癌药物长期使用的患者中后期常出现心力衰竭症状。阿霉素是一种有效且常用的化疗药，具有剂量依赖的心脏毒性，使其在临床使用中受到限制[1]。因此，迫切需要找到新的辅助治疗方案，降低化疗过程中对心脏的毒副作用，保护心脏。

从丹参和川芎中提取而成的冠心宁片（GXN），具有活血化瘀，通脉养心的功效。本课题组前期的研究表明，冠心宁片具有抗炎、降低炎症因子水平、降低心肌耗氧量、调节缺血缺氧状态下的氧代谢和能量供需平衡,改善心衰小鼠的心肌细胞凋亡等多途径多靶点的作用[2-4]。越来越多的证据表明冠心宁片在临床上对心衰防治有益，但其治疗作用的分子机制仍然未知，基于此，本研究观察冠心宁片对阿霉素诱导的心衰大鼠心脏的保护作用，探讨冠心宁片的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验药物：冠心宁片，批准文号：国药准字Z20150028，由正大青春宝药业有限公司提供。地高辛片，批准文号：国药准字H33021738，由赛诺菲（杭州）制药有限公司提供。注射用盐酸多柔比星（阿霉素），批准文号：国药准字H33021980，由瀚晖制药有限公司提供。

1.2 实验动物：SPF级雄性SD大鼠30只，6～8周龄，体重180～220g，购于杭州医学院[SCXK（浙）2019-0002]，饲养于浙江省中医药研究院SPF级屏障实验室[SYXK（浙）2019-0010]，环境温度：（22±2）℃，相对湿度50%～65%，光照12h明暗交替，噪音＜50dB。实验期间，遵循3R原则给予实验动物人道主义的关怀。伦理审查批号：浙中研动物伦理审字第[2022]014号。

1.3 主要试剂与仪器：分述如下。

1.3.1 主要试剂：NT-proBNP试剂盒（H334-1-1/20220516）、IL-1β试剂盒（H022-1-1/20220516）和IL-18试剂盒（H015-1-1/20220516）购于南京建成，β-actin（B661202）及PCR引物的设计合成购于生工生物；TRTzol Reagent RNA提取试剂（15596-026）购于invitrogen公司；PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒（RR036A）、TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ 试 剂 盒（RR820A）购于日本 TaKaRa公司。

1.3.2 主要仪器：M9vet小动物超声影像系统（深圳迈瑞动物医疗有限公司）；脱水机及包埋机（湖北贝诺医疗科技有限公司）；转轮式切片机（徕卡显微系统上海有限公司）；Power Wave XS型全波长酶标仪（Gene Company Limited）。

1.4 实验方法：分述如下。

1.4.1 模型的建立与分组给药：将30只SD大鼠（雄性）按体质量随机分成5组，即为正常对照组、模型对照组、GXN低剂量组（600mg/kg）、GXN高剂量组（1200mg/kg）、地高辛组（0.05mg/kg），每组6只。正常对照组和模型对照组每日灌胃纯水10mL/kg，GXN低、高剂量组、地高辛组每日对应的剂量连续给药9周。给药的当天开始阿霉素造模，每5天腹腔注射（i.p.）2.5mg/kg，连续7次，累积浓度17.5mg/kg。

1.4.2 状态观察：试验中，观察大鼠的精神状态，二便情况及毛色状态，并统计存活情况。

1.4.3 超声心动图检测：给药9周时行超声心动图检测。大鼠异氟烷诱导麻醉后，使用超声影像系统记录 M型超声心动图。选取连续 3个心动周期上测量各指标取其平均值。统计各组大鼠左室舒张末期室间隔厚度（IVSd）、左室舒张末期内径（LVIDd）、左室后壁舒张末期厚度（LVPWd）、舒张末期容积（EDV）、左室收缩末期室间隔厚度（IVSs）、左室收缩末期内径（LVIDs）、左室后壁收缩末期厚度（LVPWs）、收缩末期容积（ESV）、每搏输出量（SV）、射血分数(EF)和短轴率（FS）等指标。

1.4.4 血液指标检测：大鼠行颌下静脉取血，分离血清备用，用于测定N末端脑利钠肽前体（NT-proBNP）水平。

1.4.5 心肌组织病理学观察：取大鼠心脏非心尖部分置于10%中性甲醛溶液中固定1周后，脱水，透明，浸蜡，包埋。制成蜡块后，用切片机切成4μm薄片，待用于病理染色分析。①苏木素-伊红（HE）染色：行HE染色，扫描后用K-Viewer观察心肌组织病理变化。②Masson染色：Masson染色按照试剂盒说明书进行，评估心肌纤维化程度，使用Image-ProPlus软件测算每个切片各视野的心肌组织胶原容积分数（CVF）（CVF=胶原蓝色阳性面积 /心肌组织总面积×100%）[5]。

1.4.6 RT-PCR检测焦亡相关基因的蛋白表达：使用TRIzol法提取各组心肌组织的RNA，按照试剂盒说明进行逆转录反应和Real-time PCR检测。逆转录反应条件：37℃ 15min，85℃ 5s，4℃保存。RT-PCR反应条件：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，40 个循环；熔解曲线95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s。以β-Actin作为内参基因，通过2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量，各目的基因的引物序列。见表1。

表1 定量PCR的引物序列

1.5 统计学方法：用SPSS 19.0软件和Image-Pro Plus分析数据，以平均数±标准差（±s）表示，计量资料应用ANOVA方差分析评价试验结果，组间比较采用LSD分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察：正常组大鼠状态良好，毛色光亮顺滑，实验期间未出现死亡；模型对照组大鼠前4周未见明显异常，第5周开始出现轻微腹水，状态萎靡，后期出现严重腹水、腹泻症状，期间死亡1只；冠心宁低、高剂量组和地高辛组状态均较模型组有所改善，期间均未出现死亡。

2.2 大鼠心脏结构和功能改变：9周后，与正常对照组比，模型对照组 IVSd、IVSs、LVPWs、SV显著减小（P＜0.01，P＜0.05），LVIDs、ESV显著增加（P＜0.01），FS、EF显著降低（P＜0.01），心率显著减缓（P＜0.05）。与模型对照组相比，GXN低剂量组IVSs、SV、FS、EF和HR（P＜0.01，P＜0.05）显著增加；GXN 高剂量组 IVSs、LVIDs、SV、FS和EF（P＜0.01，P＜0.05）显著增加，ESV（P＜0.01）显著降低；地高辛组IVSs、LVIDs、FS和EF（P＜0.01，P＜0.05）显著增加，ESV（P＜0.01）显著降低。见图1。

图1 大鼠超声心动图指标分析

2.3 血清NT-proBNP的指标变化：给药9周后，与正常组相比，模型组的NT-proBNP显著升高（P＜0.01）；给予不同剂量的冠心宁片和地高辛后，各组的NT-proBNP较模型组均显著降低（P＜0.01，P＜0.05）。见图2。

图2 大鼠血清NT-proBNP变化

2.4 冠心宁片对大鼠心肌病理形态的影响：HE染色显示，正常对照组心肌细胞排列致密规则，细胞核呈椭球形，位于细胞中央，细胞形态完整，间隙清楚分明，周围血管清晰，有薄层结缔组织；模型对照组心肌组织分布不规则，结构杂乱，心肌细胞形态改变，肌纤维增厚，部分肌纤维断裂，心肌细胞肥大，间隙增大，血管的基本结构丧失不饱满，结缔组织增生，炎症细胞浸润。给予不同浓度的冠心宁片和地高辛后，心肌组织损伤有一定的改善，心肌组织排列较为紧密，肌纤维断裂的情况显著改善，血管形态和外膜结缔组织得到控制，炎症浸润减少。见图3。

2.5 冠心宁片对大鼠心肌纤维化的影响：Masson染色显示，正常组心肌细胞形态正常，无明显的胶原沉积。模型组细胞间隙大量胶原纤维沉积，给予冠心宁片后，细胞间隙的胶原纤维明显减少。见图4。

图4 大鼠心肌组织Masson染色图（200×）

模型对照组的CVF显著高于正常对照组（P＜0.01）；与模型对照组比，各给药组及地高辛组的CVF均显著下降（P＜0.01，P＜0.05），提示冠心宁片能显著降低阿霉素诱导的心肌纤维化。见图5。

图5 大鼠心肌组织胶原容积分数

2.6 冠心宁片对焦亡相关基因表达的影响：由图6可知，模型对照组NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA水平较正常对照组均显著升高（P＜0.01），给予GXN后，NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA水平均有不同程度的降低（P＜0.01，P＜0.05）。

图6 大鼠心肌组织mRNA的差异表达

3 讨论

HF是由多种因素引起的慢性心功能障碍疾病，其最基本的原因是心脏收缩或舒张功能障碍，导致心脏射血无法满足机体的需求[6]。中医学对心力衰竭没有明确的定义，根据辨证论治和病因病机多将其归为“胸痹”“真心痛”[7]。冠心宁是根据中医学“活血化瘀”理论和多年临床经验总结而来，用于治疗心脏疾病的代表复方，主要由丹参和川芎组成。同时，现代药理学研究发现，丹参和川芎中的多糖类和酚酸类在心血管治疗中起到了重要作用[8]。

蒽环类化疗药阿霉素作为有效的化疗药，常导致心脏毒副作用，主要表现为左心室功能障碍最终导致充血性心衰和扩张性心肌病，本研究运用该原理通过多次阿霉素腹腔注射建立心衰模型[9]。本研究结果显示，冠心宁片能改善HF大鼠的存活情况，降低血清NT-proBNP、IL-1β和IL-18水平，表明冠心宁片对阿霉素诱导的心衰大鼠心脏有保护作用。

阿霉素诱导的心衰表现为心肌扩张、结构重塑[10]超声心动结果显示IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs均显著降低，ESV显著增加，冠心宁片干预后，没有模型对照组改变的那么明显，冠心宁片可延缓心肌扩张、结构重塑。本研究显示，阿霉素诱导的心衰大鼠SV、EF、FS显著降低，表明心脏功能严重损伤，GXN干预后，这些指标显著增加，提示GXN可保护阿霉素诱导的心脏功能损伤，但是与给药剂量并没有明显的依赖性，可能与剂量的设置有关系。

心脏的舒缩功能与心脏的顺应性密切相关，心肌间质胶原沉积形成的纤维化是导致顺应性降低的主要原因，是各种心脏疾病末期的必然结果，是心室重构的重要形式。HE和Masson染色显示，心衰大鼠心肌发生了明显的病理改变，且产生了大面积的纤维化，冠心宁片干预后，心脏的病理改变得到显著缓解，纤维化明显减少，表明冠心宁片可抑制胶原沉积，改善心脏重塑，提示抑制心肌纤维化可能是冠心宁片保护阿霉素诱导的心衰大鼠的重要机制之一。

研究显示，阿霉素可通过氧化应激诱导活性氧的产生，从而导致NLRP3炎症小体激活，使Caspase-1活性增强，促进IL-18和IL-1β的成熟，加重炎症反应，进而导致细胞膨胀并最终溶解，从而诱导细胞焦亡[11]，并且细胞焦亡是除凋亡之外诱导心肌损伤的另一种重要形式，可导致心肌收缩功能下降，进而导致心衰。研究结果显示，模型对照组的NLRP3、Caspase-1、IL-18和IL-1β的mRNA表达显著增加，冠心宁片干预后，这些指标的mRNA有所降低，血清中IL-18和IL-1β水平亦降低，进一步证实了冠心宁片具有抵抗心肌细胞焦亡的作用。

综上所述，冠心宁片能改善HF大鼠的存活情况，改善心肌重塑，增强心脏的功能，降低心肌纤维化，其作用机制可能是通过抑制Caspase-1介导的焦亡通路来减少心肌细胞焦亡，从而保护心衰大鼠。这也为长期使用阿霉素抗癌而导致心脏毒性副作用的患者提供了新的保护策略。