冬凌草重金属·冬凌草甲素及浸出物的时空动态分布研究

马宏亮，黄燕俊，王吉文，胡倩倩，杨联林

(1.中山市中智药业集团有限公司，广东中山 528437；2.中药破壁饮片国家地方联合工程研究中心，广东中山 528437)

冬凌草为唇形科植物碎米桠[Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara]的干燥地上部分，分布于我国黄河、长江流域，其味苦、甘，性微寒，具有清热解毒、活血止痛的功效[1-2]，用于治疗咽喉肿痛、癥瘕痞块等。冬凌草的主要药效成分之一是冬凌草甲素，现代药理研究结果表明冬凌草甲素具有明显的抗癌抗肿瘤作用[3-4]。

随着经济的发展，人们对药材的安全性越来越关注，特别是外源性重金属超标问题，叶国华[5]研究指出重金属超标已经成为制约进出口的主要因素。目前文献研究[6]及调查检测发现冬凌草重金属铅含量超过5 mg/kg的现象比较多，因此，研究解决重金属含量较高的问题是保证冬凌草质量的关键技术之一。采收期是影响中药质量的重要因素之一，其对药用植物重金属的吸收富集也有重要影响[7]。但目前的文献都是以研究采收期对冬凌草主要化学成分的影响为主[8-11]，而采收期对冬凌草重金属的动态富集规律研究目前鲜见报道。因此，笔者研究重金属铅(Pb)、镉(Cd)、冬凌草甲素、浸出物在不同采收时间及不同部位的动态积累规律，以期为确定冬凌草的最佳采收期、保证冬凌草质量的安全性与有效性提供技术支持。

1 试验材料

1.1 样品新鲜冬凌草供试品均采自位于河南省的中智冬凌草种植基地试验田，于2018年采集不同生长期的冬凌草样品，采摘时间分别为7月12日、8月15日、9月22日、10月25日、11月15日。所有样品均在09：00—11：00采收，每个时间点分别采集3个平行样品，采集时多点随机割取植株，每个平行样品采集量约为3 kg。采集后趁鲜将每份样品快速分成3等份，1份为全株，其他2份进行茎叶分开(分成叶片部位和茎枝部位)，称鲜重。然后在65 ℃烘干至恒重，再分别称量干重。所有样品经由中山市中智药业集团有限公司马宏亮高级工程师鉴定为唇形科植物冬凌草[Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara]。

1.2 仪器iCAP-Q 型电感耦合等离子体-质谱仪(美国Thermo Fisher公司)；Mars6型微波消解仪(美国CEM公司)；BHW-09C 型恒温加热器(北京恒奥德仪器仪表有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学技术仪器有限公司)；电子分析天平(美国METTLER TOLEDO公司)；超高效液相色谱仪(ACQUITY，美国Waters公司)；色谱柱(ACQUITY UPLC BEH C18，2.1 mm×10.0 mm，1.7 μm，美国Waters公司)；超声波清洗器(KQ-500E，昆山市超声仪器有限公司)。

1.3 药品及试剂镉、铅的1 000 μg/mL标准溶液(国家有色金属及电子材料分析测试中心)；65%硝酸(分析纯，德国默克公司)；冬凌草甲素对照品(中国食品药品检定研究院，批号111721-201704，纯度99.7%)；乙腈(色谱纯，美国赛默飞世尔公司)；无水甲醇(分析纯，北京化工厂)；乙醇(分析纯，广州化学试剂厂)。

2 试验方法与结果

2.1 重金属Cd、Pb富集量测定

2.1.1标准溶液的制备。将原始质量浓度为1 000 μg/mL的镉、铅标准溶液临用前稀释为所需浓度，保证待测样品质量浓度在标准曲线范围内，具体见表1。

表1 镉、铅的标准曲线

2.1.2供试品溶液的制备。取干燥的冬凌草样品，打粉，过四号筛，准确称取0.5 g冬凌草各部位样品粉末，放入聚四氟乙烯消解罐中，精确加入8 mL 浓硫酸，放入恒温加热器中120 ℃预加热20 min，再放入微波消解仪中，按以下程序进行消解：10 min升至130 ℃，维持3 min；随后3 min 升至150 ℃，维持3 min；随后4 min升至190 ℃，维持20 min 消解。完毕后冷却至室温，取出放置通风橱内将酸挥发尽，用超纯水定容至50 mL。

2.1.3ICP-MS 条件。工作参数为正向功率1 548.6 W，冷却气(Ar)流量 13.86 L/min，辅助气(Ar)流量 0.79 L/min，雾化器气体流量 1.0 L/min；采集条件为运行时间16 s，驻留时间 0.02 s，重复次数 3 次。

2.1.4方法学考察。冬凌草中重金属镉、铅的方法学考察结果显示，其精密度、24 h稳定性、重复性、加样回收率的 RSD 均小于5.0%。

2.1.5样品重金属检测。由图1可知，随着采收月份的变化，重金属Pb、Cd的富集量也随之变化。Pb和Cd在冬凌草不同发育时期的富集量均呈先降低后增加再随之降低的变化趋势。茎、叶、全株的Pb含量在8月份最低，分别为1.20、1.65、1.46 mg/kg，而在9月份含量最高，分别为2.11、3.67、3.22 mg/kg，分别是最低值的1.76、2.22、2.21倍；方差分析结果表明，9月份不同部位Pb含量与8月份比较，均存在显著差异。同样，茎、叶和全株Cd在8月份含量最低，分别为0.04、0.05、0.05 mg/kg，而在9月份含量最高，其最高值均为0.20 mg/kg，分别是最低值的5、4、4倍；方差分析结果表明，不同部位Cd含量在9月份与8月份之间存在显著差异。

注：不同小写字母表示相同采收时间不同部位间差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示相同部位不同采收时间之间差异显著(P<0.05)

从冬凌草不同部位的分布分析，重金属Pb含量在同一时期均呈现叶片>全株>茎的分布规律，其中叶片的平均富集量是茎的1.7倍；方差分析表明，在7、9、10月，叶和全株的Pb含量之间无显著差异，但两者都与茎的含量之间存在显著差异；而在8、11月，Pb在各部位的含量差异都不显著。而相同时期Cd在冬凌草不同部位的富集量无显著差异。以上结果说明，重金属Pb主要富集在冬凌草叶片部位，从重金属外源安全性角度出发，选择在8月份采收冬凌草其安全性最高。

2.2 冬凌草甲素的含量测定

2.2.1对照品溶液的制备。取冬凌草甲素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每l mL含60 μg的溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备。取本品粉末(过四号筛)约l g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，称定重量，放置30 min，超声处理(功率250 W、频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.22 μm的有机微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2.3HPLC检测条件。按照高效液相色谱法(通则0512)测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(55∶45，v∶v)为流动相；检测波长为239 nm。理论板数按冬凌草甲素峰计算不低于4 000。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.2.4方法学考察。冬凌草中冬凌草甲素的方法学考察结果显示，其精密度、24 h稳定性、重复性、加样回收率的RSD均小于5.0%。

2.2.5冬凌草甲素的检测。冬凌草甲素是评价冬凌草品质的关键指标之一。由图2可知，不同部位冬凌草甲素在不同月份的动态变化规律基本均呈现先增加后减少的趋势，但最高值和最低值出现的时间存在差异。在叶中，冬凌草甲素含量最高值为8月份的0.88%，最低值为7月份的0.51%，两者差异显著；10月份含量比9月份略上升，之后11月份又下降，但3个月份之间差异不显著。在茎中，冬凌草甲素含量最高值为9月份的0.07%，最低为10月份的0.02%，两者差异显著，其他月份含量之间差异不显著。在全株中，冬凌草甲素含量最高值出现在9月份，最低值出现在11月份，分别为0.58%、0.28%，最高值9月份与其他月份含量之间存在显著差异，7、8、10月份的含量之间差异不显著，7、8月份的含量均与11月份最低值差异显著。从不同部位的分布分析结果可知，冬凌草甲素主要分布在叶上，其平均含量为0.71%，是茎中含量(0.04%)的17.75倍。方差分析表明，除7月份冬凌草甲素在叶和全株的含量之间无显著差异外，在其他相同月份，冬凌草甲素含量在不同部位之间都存在显著差异。

注：不同小写字母表示相同采收时间不同部位间差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示相同部位不同采收时间之间差异显著(P<0.05)

2.3 冬凌草浸出物的测定与分析按照醇溶性浸出物测定法(通则2201)项下的热浸法测定，用乙醇作溶剂，结果如图3所示。由图3可知，浸出物在叶及全株中的动态变化规律一致，为高—低—高—低—高的变化趋势，而在茎中的变化趋势为高—低—高。在叶中，浸出物在7、9和11月出现3个几乎相同的峰值，其含量分别为17.3%、16.7%、17.2%，差异不显著；而在8和10月出现2个几乎相同的谷值，分别为13.0%、13.2%。在全株中，浸出物含量最高值为7月的15.4%，其次为9月的13.4%，两者差异不显著，最低为10月的9.5%，其与前两者存在显著差异。在茎中，浸出物含量最高值为7月的7.9%，但其与8、10和11月的浸出物含量差异不显著；最低值为9月的5.1%，其与最高值之间差异显著。浸出物同样在叶中含量最高，其平均值为15.5%，是茎(6.8%)的2.28倍；方差分析表明，7、8月的浸出物含量在叶与全株之间无显著差异，但两者与茎的含量差异显著；而在其他相同月份，浸出物含量在不同部位之间都存在显著差异。

注：不同小写字母表示相同采收时间不同部位间差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示相同部位不同采收时间之间差异显著(P<0.05)

3 结论

以全株为分析对象，通过对重金属、冬凌草甲素、浸出物指标综合评价，结果发现，重金属Pb和Cd在8月份富集量最低，而且与9月份的最高值存在显著差异；冬凌草甲素在9月的含量最高，与8月份第二高值存在显著差异；浸出物最高含量为7月份，其次为9月份，但两者差异不显著；叶中冬凌草甲素与浸出物的含量均显著高于茎。综合以上结果，建议冬凌草的最佳采收期为8—9月，如果产地环境容易造成重金属超标，则建议在8月份采收比较合理，可以最大程度降低重金属污染对冬凌草造成的安全性问题；而对于重金属含量比较低的产区，建议在9月份采收，可以在保证安全的基础上最大程度提高冬凌草甲素含量，保证质量。叶片在干燥、运输等过程中极易破碎、脱落及损耗，故应注意叶片损耗造成的品质下降问题，此外建议在制定冬凌草商品规格等级标准时应控制叶的比重，以及在检测时抽样必须有代表性。

综上所述，该研究首次以重金属Pb与Cd、冬凌草甲素及浸出物为质量评价指标，阐明了各项指标在冬凌草不同部位、不同采收期的时空动态变化规律，为指导合理采收冬凌草、保障其安全性和有效性提供科学依据。