电针“水沟”对大鼠急性脑梗死后远隔部位继发性损伤的影响

李兰竹，莫燕丽，陈书俞，潘嘉欣，徐林新，刘建浩

（1.广州中医药大学研究生院，广东广州 510006；2.三亚市中医院，海南三亚 572000）

急性脑梗死（acute cerebral infarction），是指因脑部血流灌注障碍导致脑部供血供氧不足，引发局限性脑组织缺血性坏死或软化[1]。脑梗死后继发远隔功能障碍多伴随皮层扩散性抑制（cortical spreading depression，CSD），CSD引起细胞内外离子环境的改变进而抑制神经元的自发活动，表现为脑电信号减弱和刺激引起的远隔部位缺乏响应[2]，最终导致远离梗死灶、非受损脑供血区发生继发性损害的现象[3]。海马CA1区为急性脑梗死后远隔功能障碍发生的主要病灶，该区神经星形胶质细胞（astrocytes）对缺血缺氧伤害极为敏感，占急性脑梗死后远隔区受损靶细胞的78%～86%[4]。课题组前期研究发现，电针水沟穴可通过调控星形胶质细胞活性有效保护急性脑梗死大鼠神经功能[5]。本研究构建了大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）伴随CSD大鼠模型，进一步观察电针水沟穴对大鼠急性脑梗死后远隔部位继发性损伤的治疗作用及机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60只SPF级健康成年雄性SD大鼠，体质量（250±30）g，由上海中医药大学动物中心提供，动物许可证号：SCXK（沪）2018-0004。动物实验过程均依照我国科技部2006年颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》进行。

1.2 主要试剂与仪器 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司）；兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体、兔抗单羧酸转运体1（MCT1）抗体（中国Bioworld公司）；兔抗β-actin抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；山 羊 抗 兔IgG H&L（FITC）（美国Abcam公司）；Na+-K+-ATP酶酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒、蛋白定量试剂盒（考马斯亮蓝法）、苏木素染液（上海代轩生物科技有限公司）。华佗牌一次性无菌针灸针（0.25 mm×13 mm，苏州医疗用品厂有限公司）；HANS-200E韩氏穴位神经刺激仪（南京济生医疗科技有限公司）；Mini-14k微型高速离心机（常州迈科诺仪器有限公司）；倒置荧光显微镜、成像系统（日本尼康公司）；Amersham Imager 600化学发光成像系统（美国GE Healthcare公司）。

1.3 造模方法

1.3.1 构建MCAO大鼠模型 参照改良Zea Longa法[6]。将大鼠麻醉后仰卧位固定于手术台上消毒，沿颈前正中线切开皮肤及皮下筋膜，沿胸锁乳突肌内缘钝性分离肌肉，分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），在CCA及ECA下分别穿丝线备用。结扎CCA近心端和ECA，用小动脉夹暂时夹闭ICA，然后在距CCA分叉处3 mm的ECA上剪一“V”字形小口，将栓线插入ICA，将绕在CCA远心端的细线轻轻地系牢栓线。用眼科镊轻推栓线感觉有阻力时停止进线，进线距离血管分叉处18～22 mm，将血管松到初始的状态，确保线栓标记点相对于血管分叉处没有变化，紧紧系牢ECA远心端的细线。大鼠麻醉苏醒后若出现同侧Horner征及对侧前肢为主的偏瘫则表示造模成功。

1.3.2 构建MCAO伴CSD大鼠模型 将MCAO大鼠置于立体定位仪上，在左侧额骨钻一直径约3 mm的小孔为诱导CSD窗口（位于左侧半球的躯体感觉皮层区，在成像窗口之外），以此为E1点（前囟前1～3 mm、中线旁2～4 mm），保持硬脑膜的完整。将一小张浸润有5 mol/L KCl溶液的滤纸敷于小孔上，每20 min更换一次滤纸，持续2 h。采用机械针刺的方式诱导产生CSD，针刺时尽可能避开血管，以海马CA1区（AP-3.3 mm，ML 2.2 mm，DV 3.0 mm）为E2点。针尖进入持续2 s后拿出，此诱导方式可以保证只产生单波CSD[7]。银球电极放置于躯体感觉皮层的E1处和于海马远隔CA1区的E2处，分别记录下2个位点在CSD传播过程中的胞外直流电位（direct current，DC）和脑电信号（electrocorticogram，ECoG）。E1电极记录到的DC电位负向翻转和ECoG脑电活动的抑制先于E2电极，证明了CSD的扩散性去极化和扩散性抑制过程形成，表示MCAO伴CSD大鼠模型造模成功[8]。同时用Ag-AgCl电极记录左侧海马CA1区的电位变化，另一个Ag-AgCl电极放置于颈部皮下作为参考电极。CSD电位的监测和记录采用生物信号采集分析系统（MS4000U system美国）收集，实验过程保持环境稳定安静，待基线稳定后连续监测记录相应时长，其余各组在相应时间段均进行电生理学记录。数字化后的变量数据记录存储于相连的装有模数转换器的资料采集程序。

1.4 分组 将60只大鼠随机分为假手术组、MCAO组、MCAO+CSD组、电针组，每组又分为3个亚组，即造模后6 h、24 h、72 h，每个亚组5只大鼠。MCAO组大鼠构建MCAO模型，MCAO+CSD组、电针组大鼠构建MCAO伴CSD模型，假手术组大鼠只需将线栓插入10 mm左右，其余操作同MCAO大鼠模型制备。消毒后缝合皮肤，单笼饲养大鼠。

1.5 针刺方法 电针组：针刺治疗于MCAO伴CSD模型造模成功后开始实施。操作者轻握固定大鼠，酒精棉球清洁鼻下，用0.5寸针灸针于水沟穴（唇裂鼻尖下1 mm正中）处[9]进针，向上斜刺2 mm，并在该部位下约2 mm处刺入一针作为参考电极。针灸针连接韩氏穴位神经刺激仪：选择电针模式，水沟穴接电针仪负极，参考电极接正极，用5 Hz、20 mA、连续波电刺激持续30 min。分别于各亚组相应时间治疗1次。假手术组、MCAO组、MCAO+CSD组不予任何干预。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 神经功能缺失评分 参考Zea Longa评分法[6]，记录大鼠神经行为障碍评分：没有神经损伤症状，计0分；梗死对侧前爪伸直困难，计1分；行走时向偏瘫侧转圈，计2分；站立不稳，行走时向偏瘫侧倾倒，计3分；意识丧失，不能自发行走，计4分。1～4分表示造模成功。

1.6.2 TUNEL染色法观察海马远隔CA1区神经细胞凋亡 各亚组处死大鼠，取出海马组织，制备石蜡切片；石蜡切片60℃烘烤2 h，二甲苯脱蜡2次，每次15 min；下行乙醇溶液水合，室温下蛋白酶K消化30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；稍甩干后滴加破膜工作液覆盖组织，常温孵育20 min，PBS洗涤3次，每次5 min；暗湿盒中滴加TUNEL反应液50μL 37℃孵育2 h，PBS漂洗；暗湿盒中滴加POD反应液50μL 37℃孵育30 min，PBS漂洗；室温下DAB显色，PBS漂洗；苏木素复染，温水返蓝；上行乙醇溶液脱水，二甲苯透明，封片。每只大鼠选1张切片，10×10倍荧光显微镜下定位脑梗死灶海马CA1区阳性表达“热点区”，10×20倍镜下观察不重叠5个视野并拍照。采用ImagePro Plus 6.0软件进行阳性细胞计数，取5个视野下的均值。计算海马远隔CA1区神经细胞凋亡指数，细胞凋亡指数（apoptotic index，AI）=阳性细胞总数/细胞总数×100%。

1.6.3 定磷法测定海马远隔CA1区Na+-K+-ATP酶活性 处死各亚组大鼠，于低温环境下取海马远隔CA1区脑组织制成匀浆。严格按照试剂盒说明书要求进行操作。用酶标仪在660 nm波长处检测OD值，计算Na+-K+-ATP酶活性。ATP酶活力＝{[（测定OD值-对照OD值）-（标准OD值-空白OD值）]标准品浓度×6×7.8}/待测样本蛋白浓度。

1.6.4 免疫荧光标记法检测海马远隔CA1区MCT1/GFAP阳性共表达情况 处死各亚组大鼠，取海马远隔CA1区组织制备冰冻切片。将切下的脑片采用Tween 20-Tris缓冲盐溶液漂洗2次，每次5 min；用5%山羊血清于37℃封闭1.5 h；分别加入一定比例稀释的一抗MCT1（1∶1 000）、GFAP（1∶500），4℃孵育18 h，PBS液漂洗3次，每次10 min。以下步骤均避光：加入二抗山羊抗兔FITC-IgG（1∶1 000）37℃孵育2 h，DAPI复染5 min，PBS液漂洗3次，每次10 min；滴加抗荧光淬灭封片液，盖玻片封片，4℃保存。随机选取10个视野在荧光显微镜下观察，使用ImagePro Plus 6.0软件分析10个视野平均荧光强度观察MCT1、GFAP共标记阳性细胞表达情况。

1.7 统计方法 采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间一个因素比较，经正态分布检验（One-Sample Kol-mogorov-Smirnov test，K-S检验），符合正态分布的数据，再进行方差齐性检验。重复测量数据：若满足球形对称假设，进行重复测量方差分析；若满足齐性，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用LSD法。方差不齐，则应用Tamhane’s T2方差分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时相神经功能缺损评分比较 图1结果显示，由造模后评分可知，假手术组未出现神经功能缺损，MCAO组、MCAO+CSD组、电针组大鼠造模后0、6、24、72 h时相神经功能缺损评分均为1～3分，表明造模成功。各组治疗后神经行为学评分比较：与MCAO组同时相比较，MCAO+CSD组6 h时相神经功能缺损评分明显升高（P＜0.05），0、24、72 h时相差异无统计学意义（P＞0.05）；与MCAO+CSD组同时相比较，电针组6、24、72 h时相神经功能缺损评分均明显降低（P＜0.05）。

图1 各组大鼠不同时相神经功能缺损评分比较（±s）Figure 1 Comparison of neurologicaldeficit scores among various groups of rats in different phases（±s）

2.2 各组大鼠不同时相海马远隔CA1区神经细胞凋亡情况比较 如图2所示，TUNEL染色阳性产物主要表达在细胞核，呈棕黄色颗粒。荧光显微镜下可见，正常脑组织皮层神经细胞核显蓝色，凋亡细胞核呈深浅不一的棕黄色，形态呈碎点状，不规则，大小不一。假手术组少见阳性凋亡细胞，MCAO组、MCAO+CSD组凋亡细胞较多。图3结果显示：与假手术组比较，MCAO组、MCAO+CSD组、电针组大鼠在6、24、72 h时相的神经细胞凋亡指数均明显升高（P＜0.05）；与MCAO组比较，MCAO+CSD组3个时相神经细胞凋亡指数均明显升高（P＜0.05）；与MCAO+CSD组比较，电针组3个时相神经细胞凋亡指数均明显降低（P＜0.05）。

图2 各组大鼠不同时相海马远隔区TUNEL阳性细胞分布情况Figure 2 The distribution of TUNEL-positive cells in the hippocampal distal region in various groups of rats in different phases

图3 各组大鼠不同时相海马远隔CA1区神经细胞凋亡指数比较Figure 3 Comparison of the apoptotic indices of neuronal cells in the distalCA1 region of the hippocampus among various groups of rats in different phases（±s）

2.3 各组大鼠不同时相海马远隔CA1区Na+-K+-ATP酶活性比较 图4结果显示：与假手术组比较，MCAO组、MCAO+CSD组6、24、72 h时相海马远隔CA1区Na+-K+-ATP酶活性均显著降低（P＜0.05）；与MCAO组比较，MCAO+CSD组6、24 h时相Na+-K+-ATP酶活性显著降低（P＜0.05），在72 h时相无显著差异（P＞0.05）；与MCAO+CSD组比较，电针组6、24 h时相Na+-K+-ATP酶活性均显著提高（P＜0.05），在72 h时相无显著差异（P＞0.05）；电针组3个时相的Na+-K+-ATP酶活性与假手术组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图4 各组大鼠不同时相海马区远隔CA1区Na+-K+-ATP酶活性比较（定磷法）（±s）Figure 4 Comparison of the Na+-K+-ATPase activity in the distalCA1 region of the hippocampus among various groups of rats in different phases（determining phosphorus method）（±s）

2.4 各组大鼠不同时相海马远隔CA1区MCT1/GFAP共标记表达情况比较 如图5所示，应用荧光共聚焦显微镜下观察各组大鼠海马CA1区星形胶质细胞的特异性标记物MCT1、GFAP抗体共同阳性表达，以判断电针水沟穴是否同时在星形胶质细胞产生效应。荧光显微镜下可见，DAPI染色的星形胶质细胞呈蓝色荧光，目的细胞GFAP阳性表达经双染（Merge）后呈红色荧光，MCT1呈蓝绿色荧光，表明海马远隔CA1区内有星形胶质细胞MCT1/GFAP阳性共表达。

图5 各组大鼠不同时相海马远隔CA1区MCT1/GFAP共标记表达情况Figure 5 Expression of MCT1/GFAP co-labeling in the distalCA1 region of the hippocampus in various groups of rats in different phases

图6结果显示：与假手术组比较，MCAO+CSD组6、24、72 h时相海马远隔CA1区MCT1/GFAP共标记表达量均显著升高（P＜0.05），MCAO组、电针组24 h时相MCT1/GFAP共标记表达量显著升高（P＜0.05），在其余时相差异均无统计学意义（P＞0.05）；与MCAO组比较，MCAO+CSD组3个时相MCT1/GFAP共标记表达量显著升高（P＜0.05），电针组24 h时相MCT1/GFAP共标记表达量显著降低（P＜0.05）；与MCAO+CSD组比较，电针组3个时相MCT1/GFAP共标记表达量均显著降低（P＜0.05）。

图6 各组大鼠海马远隔CA1区MCT1/GFAP共标记阳性表达强度比较（免疫荧光标记法）（±s）Figure 6 Comparison of positive expression intensity of MCT1/GFAP co-labeling in the distalCA1 region of the hippocampus among various groups of rats（immunofluorescence labeling method）（±s）

3 讨论

《针灸大成》曰：“督脉起于下极之腧，入脑上巅。”水沟穴隶属于督脉，有醒脑开窍之功效。本研究结果显示，与MCAO+CSD组比较，电针组6、24、72 h时相神经功能缺损评分均明显降低（P＜0.05），表明电针水沟穴后，急性脑梗死大鼠的神经功能明显改善，且起效较快。MCAO+CSD组神经细胞凋亡指数在24 h时相达到（61.84±4.91）%，提示CSD在被机械电刺激后由缺血灶向远隔区慢性负向播散。而电针水沟穴在24、72 h时相海马远隔CA1区神经细胞凋亡指数较同时相MCAO+CSD组明显下降（P＜0.05），表明电针组CSD的发生频率降低，海马远隔CA1区神经细胞凋亡显著减轻，提示电针水沟穴对急性脑梗死大鼠局灶缺血区神经细胞凋亡进行性加重趋势亦有一定的缓解作用。

本课题组前期实验结果显示，病灶周围、远隔部位甚至对侧脑组织均发生细胞凋亡、物质代谢障碍和离子环境改变[5]。脑梗死后神经元氧供急速下降，细胞膜通透性增加，三磷酸腺苷（ATP）迅速耗竭被视为细胞凋亡前步骤[10]。星形胶质细胞-神经元在三羧酸循环中能量耦联，增加脑内无氧糖酵解，将葡萄糖分解为乳酸，通过单羧酸转运体（MCT）释放到细胞外间隙形成“乳酸池”，提供部分能量底物。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是合成星形胶质细胞的主要原料之一，可维持神经突触张力强度。脑损伤后，MCT1主要在GFAP阳性细胞表达，其聚合物分解可溶性GFAP片段释放到周围组织，促使星形胶质细胞迅速分裂、增殖，GFAP阳性表达代偿性剧增[11]，形成胶质瘢痕，阻碍神经组织的再生与功能重建[12]。研究表明，MCT1、GFAP水平与缺血性脑卒中预后呈负相关，即MCT1、GFAP水平越高，预后越差[13]。本研究结果显示，电针组大鼠6、24、72 h时相海马远隔CA1区MCT1/GFAP共表达量较MCAO+CSD组显著降低（P＜0.05）。脑缺血损伤后星形胶质细胞活化，随着缺血时间延长胶质瘢痕增生不利于神经元修复，本研究结果表明电针水沟穴可抑制急性脑梗死大鼠海马远隔部位星形胶质细胞过度增生，降低脑梗死远隔部位功能的迟发性损伤。

Na+-K+-ATP酶又称为钠泵，是存在于组织细胞及细胞器生物膜上的一种蛋白酶，对缺血、缺氧非常敏感。Na+-K+-ATP酶是维持细胞内外Na+、K+浓度梯度保持细胞膜电位，提供神经冲动传递驱动力的关键酶[14]。神经元Na+-K+-ATP酶活性激活对脑缺血缺氧损伤具有保护作用[15]。本研究结果显示，MCAO组、MCAO+CSD组海马远隔CA1区Na+-K+-ATP酶酶活性较假手术组显著降低（P＜0.01），电针水沟穴可以上调6、24 h时相Na+-K+-ATP酶活性，起到改善远隔区缺血脑组织细胞代谢功能的作用。电针组3个时相Na+-K+-ATP酶活性与假手术组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示电针水沟穴可通过调节Na+-K+-ATP酶活性促进急性脑梗死发作后72 h内海马远隔CA1区神经细胞Na+、K+离子转运，维持离子自稳平衡，保护神经元功能。

综上所述，电针水沟穴可抑制急性脑梗死大鼠CSD由梗死区向远隔区海马结构扩散程度，显著减轻远隔CA1区神经细胞凋亡。电针水沟穴可能通过提高ATP酶活性，经Na+-K+-ATP酶信号通路改善细胞内外离子环境，减少乳酸堆积，加强突触间的联系及传导，抑制星形胶质细胞反应性胶质化的途径，抑制海马区神经细胞凋亡，减轻脑梗死后远隔功能障碍、远隔部位继发性损伤。