番红花花蕊分化期差异蛋白表达的鉴定与分析

张衡锋，张焕朝

(1.江苏农牧科技职业学院 园林园艺学院，江苏泰州 225300；2.南京林业大学 林学院，南京 210037)

花蕊分化是植物开花和花芽分化的核心阶段，是一个复杂的生理生化和形态建成过程。蛋白质组学通过寻找和筛选任何有意义因素引起的不同样本之间的差异蛋白质谱，用以揭示细胞生理的进程与本质，并对某些关键蛋白的定性和功能进行分析。近年来，蛋白质谱技术在植物开花和花芽分化方面的研究已取得了丰硕成果[1-4]。番红花(CrocussativusL.)属鸢尾科番红花属多年生三倍体鳞茎类球根花卉，原产于伊朗、小亚细亚半岛和希腊等地，中国各地常见引种栽培[5]。番红花以花柱入药，称西红花，具有活血、化瘀、生新、通经等功效，作为传统名贵中药收入《中华人民共和国药典(2020)》。番红花生境苛刻，产量极低(约8 kg/hm2)，致使价格昂贵(约10 $/g)，素有“植物黄金”之称[6]，由于其三倍体特性，难以进行有性繁殖，致使繁殖系数低、种球退化、病虫害频发，已成为制约中国番红花产业发展的关键因素。为有效解决番红花生产技术瓶颈，除传统栽培技术研究外，王莉等[7]和陈书安等[8]学者创新开展了番红花胚性愈伤组织调控和花柱-柱头状物诱导研究[7-9]，提高了番红花胚性愈伤组织和花柱-柱头状物的分化频率，但未能真正构建起花柱定向离体培养体系，缺乏花柱分化分子机理理论支持。针对番红花开花这个核心环节，张衡锋等[10]、周琳等[11]、Qian等[12]学者对其花芽结构和开花调控因子等进行了研究，这些研究为番红花生产提供了理论支持，但针对番红花开花分子机理尤其是花蕊分化机理的研究较少。

本研究聚焦番红花药用器官花蕊的分化过程，应用MALDI/TOF/TOF-MS/MS质谱鉴定与分析技术，比较分析花蕊分花期蛋白质组的变化，确定与分化过程密切相关的关键蛋白，分析其可能的功能后构建番红花花蕊分化的分子调控模型，旨在揭示番红花花蕊分化的分子机理，为番红花定向培养和标准化生产提供理论基础和科学 依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验所用番红花(CrocussativusL.)生长于江苏中药科技园(32°27′42″N, 119°55′57″E)，属于亚热带季风性气候，年降水量1 020.5 mm，全年最高、最低和平均温度分别为38.2 ℃，-7.2 ℃和14.9 ℃，全年光照1 746 h，土壤类型为高沙土，正常水肥管理。

1.2 试验材料

2020年5月10日收获仔球并储藏于阴凉通风处，2020年7月5日(番红花球茎处于休眠状态)挑选生长完好，质量(25±1)g的种球300个，置于温度(25±0.5)℃，空气湿度75%的智能培养箱中培养，全程暗培养。自放入智能培养箱中开始，每3 d用电子显微镜观察番红花球茎花芽，以花序分化出第一朵小花为准，在花被原基分花期(TD)、雄蕊原基分花期(SD)和雌蕊原基分花期(PD)(图1)，每10个番红花茎尖为1次生物学重复，重复3次。所有茎尖样品取样后立即用锡箔纸包裹并放入液氮速冻20 min，速冻后在-80 ℃条件下保存，备用。

1.3 蛋白提取

采用TCA/丙酮沉淀法[13]提取番红花样品蛋白，略作修改。1 000 mg样品(鲜质量)研磨成粉，在-20 ℃条件下用含有100 g/L三氯乙酸(TCA)、0.7 g/L DTT和1 mmol/L PMSF的丙酮溶液(-20 ℃预冷)悬浮萃取2 h。在4 ℃条件下15 000 r/min离心20 min，弃上清，再用预冷丙酮溶液漂洗萃取3次，室温下放置1 h，待丙酮挥发完全后，将沉淀物冷冻干燥后-80 ℃条件下保存。

1.4 蛋白质含量测定

采用Bradford法[14]进行番红花花芽样品蛋白含量的测定，略作修改。以100 mL 95%乙醇、200 mL 85%磷酸和500 mg考马斯亮蓝G-250制成Bradford储备液。由425 mL双蒸水、15 mL 95%乙醇、30 mL 85%磷酸和30 mL Bradford储备液制成工作液，双层滤纸过滤后，4 ℃棕色瓶保存。以1 mg/mL的BSA溶液为标准液，吸取100 μL的样品液和标准液加入到5 mL的Eppendorf管中，加入3 mL Bradford储备液混合摇匀，2 min后在分光光度计595 nm处测定吸光值，建立标准曲线，并根据标准曲线测定样品蛋白质含量。

1.5 双向电泳(2-DE)、凝胶染色和图谱分析

取1.0 mg的样品蛋白粉末，加入适量的IEF裂解液[7 mol/L urea+2 mol/L Thiourea+ 40 g/L CHAPS+0.5%(V/V)IPG buffer(24 cm linear, pH 4～7)]溶解，注入每一条IPG胶条(24 cm，pH 4～7)上。第一向固相pH梯度聚焦电泳：采用Ettan IPG-phor系统(Bio-Rad，美国)，电泳条件为20 ℃，50 μV/trip，200 V电流1 h，500 V电流1 h，1 000 V电流1 h，8 000 V电流4 h，8 000 V电流6 h。聚焦结束后，胶条进行2次平衡。第二向SDS-PAGE垂直板电泳：平衡好的胶条配置成12%的聚丙烯酰氨凝胶，灌入玻板后加饱和正丁醇封胶，凝胶完全聚合后置于SDS-PAGE胶面上，加入蛋白分子量Marker，并用 0.5%的低熔点琼脂糖封胶。待低熔点琼脂糖凝固后将玻板置于Ettan IPG-phor系统(Bio-Rad，美国)中开始电泳，1 W/胶条先电泳1 h，之后5W/胶条继续电泳，至溴酚蓝跑至离胶底1.0 cm时停止电泳。

电泳结束后用考马斯亮蓝G-250染色6 h，之后超纯水清洗至凝胶背景无色透明，蛋白点清晰为止。

所有染色的电泳凝胶用300 dpi的Image Scanner Ⅲ(GE Healthcare Life Sciences，瑞典)扫描成像，并用PDQuest 7.2软件进行图谱分析，只有蛋白点差异表达超过1.5倍和P<0.05(LSD)的变化被认定为差异表达点。所有待测样品双向电泳分析和凝胶图谱分析重复3次。

1.6 蛋白质胶内酶解、鉴定和数据库查询

参照Kumarathasan等[15]方法进行蛋白质胶内酶解，略作调整。从凝胶上切1～2 mm的蛋白点凝胶放入Eppendorf管中，加入100 μL的100 mmol/L的NH4HCO3和100 μL的50%的ACN进行脱色，冻干后加入10 μL的 12.5 ng/μL胰蛋白酶溶液酶解12 h，加入20 μL的100 mmol/L的NH4HCO3和20 μL的50% ACN和0.1% TFA，取上清液，冻干，在干燥的样品中加入10 μL的0.1%的TFA和10 μL的C18Zip脱盐，用以质谱鉴定。

采用4800串联飞行时间质谱仪(Applied Biosystems，美国)进行质谱分析，采用正离子反射模式和自动获取数据的模式进行数据采集，PMF质量扫描范围700～3 500 ku，使用解释模式自动排除胰蛋白酶自解峰、常见的角蛋白污染峰，选择强度最大的5个峰作为母离子进行串联质谱分析。

所有肽植物图谱通过MASCOT检索引擎(http://www.matrixscience.com)在植物的NCBInr数据库中进行检索。最大允许漏切位点为1，质量误差范围设置为PMF100×10-6，MS/MS为0.2 ku。

2 结果与分析

2.1 2-DE蛋白图谱和差异蛋白

从2-DE图谱中蛋白点分布来看(图2)，蛋白点的等位点主要分布于4.0～7.0，分子质量主要集中在18.5～117.0 ku，每块胶条上有超过900个蛋白点重复表现，匹配率约79%～81%。所有蛋白点中，8个点在花被原基分化期特异表达，5个点在雄蕊原基分化期特异表达，2个点在雌蕊原基分化期特异表达。相邻两个时期中，各蛋白点表现出特异、升高、下降和持平4种变化(图3)，共有81个蛋白点呈现出显著差异(表达丰度值vol%>1.5倍，P<0.05)。

2.2 差异表达蛋白的鉴定和分类

探索番红花花芽分化过程中差异蛋白的功能对探索番红花开花机理具有重要意义。根据蛋白质差异分析结果，番红花花芽分化不同时期的81个差异表达点经质谱分析及NCBInr数据库检索，75个差异蛋白得以鉴定，并对其功能进行分类(表1)，可靠鉴定率达84.27%，功能类别包括：代谢(25个，33.33%)，能量(7个，9.33%)，细胞防御(8个，10.67%)，蛋白命运(20个，26.66%)，细胞合成原件(5个，6.67%)，结合蛋白和辅助因子(3个，4.00%)，细胞周期和DNA加工(2个，2.67%)，细胞运输(5个，6.67%)。

2.3 蛋白差异表达分析

2.3.1 糖和能量代谢相关蛋白 由表1和图4可知，在差异表达的蛋白中代谢类占比最大，其中25个为调控糖代谢和能量代谢的关键蛋白，说明在番红花花蕊分化过程中，糖和能量代谢是最主要的生理反应之一。番红花花蕊分化期，功能叶尚未形成，因此此间糖代谢途径应主要是糖酵解和糖异生过程。在花蕊分化期内，颗粒结合淀粉合成酶(GBSS)活性持续下降，GBSS是唯一可以对直链淀粉生物合成起作用的关键酶[16]，说明在此期间直链淀粉的合成能力在减弱。参与糖酵解代谢的关键酶FBA、UGPase、ATPase和UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶活性呈现下降趋势，而FRK、TPI、NSE和LOS2活性呈现上升趋势，说明在众多糖代谢路径中，蔗糖经F1P产生丙酮酸途径应是番红花花蕊分化糖酵解的主要途径。乙酰-CoA羧化酶活性降低，说明乙酰辅酶A作为TCA循环底物的能力也在增强。

2.3.2 氨基酸代谢和植物信号调控相关蛋白 甲硫氨酸tRNA连接酶参与甲硫氨酸到甲硫氨酸tRNA的耦合过程，使mRNA的遗传信息准确无误地反映到甲硫氨酸序列上。由表1和图4可知，番红花花蕊分化过程中，甲硫氨酸tRNA连接酶活性的持续减弱，说明甲硫氨酸水平在降低。在精氨酸酶等酶的催化作用下，精氨酸可水解成鸟氨酸和其他含氮化合物，这些代谢物质均是蛋白质合成的重要底物，随着精氨酸酶活性的持续增强，鸟氨酸和含氮化合物水平也将随之升高。半胱氨酸是植物体内保护细胞环境不受氧化应激影响的一种氨基酸，其残基之间S-S的形成也是分子伴侣活化的关键性步骤，是一些蛋白正确折叠和稳定结构的必需物，半胱氨酸合成酶活性的增强，可维持花芽细胞不受氧化应激影响，并增加分子伴侣活性，促进花蕊细胞的分化。黄碱酮3-羟化酶可调控黄酮与花青素产物的合成，黄碱酮3-羟化酶在番红花雄蕊分化期迅速升高利于黄酮合成，进而促进雄性配子体和花粉管发育信号的传递[17]。

2.3.3 活性氧代谢相关蛋白 植物胞质中主要的活性氧代谢系统为抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循环，其中抗坏血酸过氧化氢酶(APX)是关键酶之一。鸟苷二磷酸甘露糖在甘露糖-3′,5′-异构酶(GME)的催化作用下可转变为L-甘露糖-半乳糖，其是抗坏血酸合成酶的重要底物。在细胞质内乳酰谷胱甘肽裂解酶通过一个1,2-氢转移，催化丙酮醛转化为乳酸谷胱甘肽，进而水化产生谷胱甘肽和D-乳酸盐，实现解毒作用[18]。如表1和图4所示，APX、CAT、TpxⅡ和GME活性增强，说明番红花花蕊分化过程中，花蕊细胞内出现活性氧(ROS)积累，通过活性氧代谢，将H2O2等ROS维持在一个较低水平。

2.3.4 蛋白修饰和加工相关蛋白 热激蛋白是生物受到高温或其他环境胁迫诱导产生的一种热激反应，根据分子质量大小，可分为小分子热激蛋白(分子质量小于50 ku)和大分子热激蛋白(分子质量大于50 ku)，泛素蛋白就是一种通过ATP促进细胞蛋白质水解的小分子量热激蛋白，而叶绿体HSP60和叶绿体HSP70属于诱导型大分子热激蛋白，叶绿体HSP60具有参与核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶全酶的装配和监护叶绿体内蛋白的折叠、组装的双重功能[19]。HSP70通常在植物体内表达量较少，但在应激原的作用下表达迅速增加，其兼具ATP酶活性和分子伴侣功能[20]。如表1和图4所示，在番红花花蕊分花期内，热激蛋白、泛素蛋白表达量先下降后上升，说明在番红花分化过程中，伴随着大量热激反应，保障蛋白修饰和加工顺利进行。

2.3.5 细胞结构建成相关蛋白 细胞骨架是真核细胞的重要组成部分，包括微丝、微管和中间丝，其中微丝的基本组成单位就是肌动蛋白。肌动蛋白在细胞分裂和细胞膨胀等形态建成与功能方面具有关键的作用[21]。微管蛋白与细胞壁微原纤维呈横向分布，限制细胞的横向膨胀，促进细胞纵向延长。如表1和图4所示，番红花花蕊分化过程中，肌动蛋白表达量先上升后下降，β-肌动蛋白和微管蛋白表达量持续升高，说明番红花雌蕊分化期参与的肌动蛋白主要是β-肌动蛋白。随着分化的推进，需要大量的β-肌动蛋白和微管蛋白参与细胞骨架结构的构建。当植物受到外界环境压力或接收到植物发育内在信号时，植物延伸因子(eEF1)会迅速做出反应，通过在核糖体上催化氨基酸链的延伸而推动、控制蛋白质的合成，其不仅可以将GTP和氨基酸tRNA运至核糖体上。在番红花花蕊分化过程中，eEF1A的对应物延伸因子Tu(EF-Tu)表达量上升，说明番红花花芽分化与eEF1A主导的蛋白质合成代谢密切相关。3-oxo-γ(4,5)-类固醇-5-β-还原酶可促进葡萄糖-1-磷酸向纤维素的转变，其表达水平的提高有利于细胞纤维结构的建成。

3 讨论与结论

3.1 代谢和信号调控过程

蔗糖和淀粉是高等植物碳水化合物贮藏的主要形式，也是协调植物库源关系的重要信号分子。前期研究表明，番红花花芽分化过程中，可溶性糖含量与淀粉含量显著负相关，在雄蕊分化阶段和雌蕊分化阶段，茎尖中始终维持高水平可溶性糖[22]。因此，糖酵解应是番红花花蕊分化中糖代谢和能量代谢的主要形式，以此为花蕊分化提供足够的能量。根据蛋白差异表达分析，其代谢路径可能为：蔗糖经蔗糖酶的催化分解成果糖、葡萄糖等己糖，果糖经果糖激酶(FRK)的催化可形成果糖-1-磷酸(F1P)，F1P经醛缩酶催化，形成甘油醛和磷酸二羟丙酮(DHAP)，甘油醛经甘油醛激酶的作用，最终形成3-磷酸甘油醛(G3P)，而DHAP在磷酸丙糖异构酶(TPI)的催化作用下也形成G3P，最终一分子果糖形成了两分子G3P。G3P经过氧化和磷酸化反应形成2-磷酸甘油酸(G2P)，G2P经糖分解烯醇酶(NSE)和烯醇酶(LOS2，enoslase)的催化和分子重排生成丙酮酸，丙酮酸经过氧化脱羧最终生成乙酰基辅酶A(Ac-CoA)，进入TCA循环，而苹果酸脱氢酶(MDH)和琥珀酰辅酶A连接酶正是TAC循环中的关键酶[23](图4)。

植物花芽分化伴随着大量的氨基酸代谢和植物信号调控。甲硫氨酸兼有乙烯合成前体和DNA甲基化修饰两方面的作用，而且一些DNA甲基化修饰可抑制成花基因FLC的表达[24]。甲硫氨酸水平的降低可能会导致乙烯含量和DNA甲基化修饰水平的降低，因乙烯与细胞分裂素存在拮抗作用，由此促进细胞分裂素相对水平升高和FLC的表达，这与前期研究番红花花芽分化中，茎尖中维持高水平内源CTK[22]的研究结果基本一致。鸟氨酸是多胺(PA)等重要信使分子的前体[25]，PA对于花基启动、信使RNA转录和特异蛋白翻译具有重要作用[26]，前期关于番红花花芽分化的研究中，RNA、蛋白质含量均先升高后降低，核酸与可溶性蛋白含量显著或极显著相关[10]，所以鸟氨酸水平升高极有可能促使PA等代谢产物大量产生，进而促进花蕊分化。

植物受到胁迫、缺乏营养、发育成熟过程中均会导致活性氧(ROS)的积累，低水平的ROS具有乙烯等植物激素信号传递作用，调控植物生长发育[27]，高水平ROS则会诱导植物产生应激反应，形成抗氧化防御机制。番红花花蕊分化过程中，可能因为分化过程中需要大量营养供给，从而诱发活性氧积累，APX和CAT等抗氧化酶清除过多的ROS，将ROS维持在较低水平，进而降低乙烯等植物激素水平，促进细胞分裂和生长发育，通过调控植物激素信号来推进番红花花蕊的分化进程。另外，番红花花蕊分化期处于夏季，细胞可能通过抗氧化防御机制清除高温诱发的ROS积累，获得合适的发育环境。

3.2 热激反应和细胞结构建成过程

泰州地处北亚热带湿润气候区，夏季高温多雨，气温最高在7月。番红花花蕊分化期一般从7月下旬至8月上旬，而其适合温度区间为 23 ℃～27 ℃。较高的温度会诱导热激蛋白积累，而雄蕊原基分化期热激蛋白下降可能与花粉管分化有关，与雌性组织不同，花粉管萌发过程中缺乏热激蛋白mRNA的积累，导致合成热激蛋白的能力逐渐丧失[28]，进入雌蕊原基分花期后由于热激反应，热激蛋白水平又迅速上升。

在番红花雄蕊原基分化期，茎尖分生组织继续分化花被片细胞，需要大量的微管细胞的参与。在雄蕊原基分化期，许多茎尖已经开始分化出第二小花，这可能是β-肌动蛋白持续增加的原因之一。另外，延伸因子Tu(EF-Tu)表达量与微管蛋白及磷脂酰肌醇激酶活性同步上升，可能是因为EF-Tu通过结合微管蛋白来调节细胞骨架结构和活化磷脂酰肌醇激酶[29]，具体作用机理需要进一步深入研究。

3.3 其他植物花芽分化的比较

Zhang等[2]运用转录组学和蛋白质组学方法研究百子莲(Agapanthuspraecoxssp.orientalis)开花发现：在百子莲花芽分化和开花过程中，得以可靠鉴定的蛋白主要涉及能量代谢、信号转导、蛋白命运和细胞构成；You等[3]在研究龙眼(DimocarpuslonganLour.)开花逆转过程中发现：能量代谢和活性氧代谢相关蛋白可能在花芽分化过程中发挥主要作用，这些蛋白主要包括葡糖糖-6-磷酸异构酶、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶连接酶、苹果酸脱氢酶、ATP酶，过氧化氢酶和微管蛋白等；陈一帆等[4]在研究黄连木花芽分化期差异蛋白发现：雄蕊与雌蕊分化与活性氧代谢、核糖体活动、光合作用等相关蛋白密切相关。以上研究均表明，其他植物成花过程中，绝大部分差异蛋白种类与番红花花蕊分化差异蛋白种类基本相似，只是部分蛋白在相同或相近分化期表现出不同变化趋势，这可能与植物品种以及培养环境有关。本研究通过蛋白质组学筛选和研究番红花花蕊分花期差异蛋白变化，获得了大量与番红花花蕊分化相关的新信息。本研究鉴定了75个可能在番红花花蕊分化中发挥重要作用的蛋白，这些蛋白可能参与了糖酵解、信号传导、氨基酸代谢、活性氧代谢、蛋白修饰和加工、细胞结构建成等生理作用，并据此初步构建了番红花花蕊分化的分子调控模型，为进一步揭示番红花花蕊分化调控机制提供了新依据，为番红花定向培养提供新线索。