ZmDREB2.7正调控玉米耐旱性的功能分析

刘升学，常淑杰，刘晓虎，马 超，秦 峰

(中国农业大学 生物学院，北京 100193)

玉米不仅是重要的粮食作物，同时也是重要的饲料和工业原料，而且又是对水分胁迫较为敏感的作物[1]。尽管全球玉米种植面积和产量取得了突飞猛进的增长，但是干旱、高盐碱、极端温度等非生物逆境严重影响玉米产量进一步提高。在诸多环境胁迫因素中，干旱对农业生产的威胁是最严重的一个世界性问题[2]。因此，提高农作物尤其是玉米的耐旱性已逐渐成为现代农业生产的迫切需求。然而，植物耐逆性属于复杂数量性状，单纯依靠传统的育种手段改善植物的抗逆性，已难以满足此类性状遗传改良的需要，随着植物分子生物学和基因工程技术的发展，通过分子设计的手段培育抗旱品种逐渐成为提高作物抗旱性的可能途径[3-4]。干旱是常见的严重影响农作物生长发育及产量的非生物胁迫因子之一，也是目前抗逆分子生物学研究的重要领域之一。在玉米(ZeamaysL.)、水稻(OryzasativaL.)、小麦(TriticumaestivumL.)、大麦(HordeumvulgareL.)、大豆(Glycinemax)和番茄(Solanumlycopersicum)中的研究表明，DREB/CBF、MYB、NAC、bZIP和WRKY等转录因子主要参与调控响应水分胁迫的基因表达[5-9]。诸多转基因研究结果表明，DREB/CBF转录因子基因无论是在双子叶和单子叶植物，还是在草本及木本植物的抗逆遗传改良中均有很好的应用前景[10-13]。

前期通过368份玉米自交系的苗期存活率表型与玉米基因组中18个ZmDREB基因的遗传变异进行候选基因的关联分析发现，ZmDREB2.7基因启动子区域的遗传变异与玉米耐旱性显著相关[10]。本研究利用ZmDREB2.7玉米转基因材料和近等基因系材料，在正常生长和干旱胁迫条件下，比较转基因与非转基因材料以及不同近等基因系间耐旱性，分析ZmDREB2.7基因对玉米正常生长和耐旱性的影响，以及不同ZmDREB2.7等位基因型的遗传效应。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米(ZeamaysL.)自交系A188、玉米ZmDREB2.7转基因材料、玉米自交系CIMBL70、玉米自交系CIMBL92、玉米自交系SHEN5003、ZmDREB2.7近等基因系材料、根癌农杆菌(Agrobactriumtumefaciens)菌株EHA105、中间载体质粒 pSBⅡ，均由中国农业大学玉米课题组保存。

1.2 载体的构建与鉴定

以耐旱玉米自交系CIMBL70基因组DNA为模板，将ZmDREB2.7基因(～700 bp 启动子区及 5′和 3′UTR)通过 PCR 扩增并克隆到载体 pBlueScript ⅡSK的EcoRⅤ位点。经测序确认序列正确后，经SmaⅠ和HindⅢ酶切后克隆到载体pSBⅡ。将测序和酶切证实的质粒与pSBⅠ载体电击转化农杆菌，重组后获得载体 pSBⅢ，进行转化。克隆引物序列ZmDREB2.7-1 F：5′-GTCCGTCAGTCCGTCCTTG-3′,ZmDREB2.7-1 R:5′-CCACGAATAACTAGGAGAAATA-3′，扩增片段长度为2 013 bp；标记基因序列：BAR-F:5′-CAATCCTCGAGTCTACCATGAGCCC-AGAAC-3′和BAR-R:5′-GAATCCTCGAGTC-AAATCTCGGTGACGGGCA-3′，扩增片段长度为500 bp。

1.3 ZmDREB2.7转基因材料的创制

取授粉后10～15 d的A188幼穗剥去苞叶，剥离花丝，先用75%酒精浸泡幼穗15 s，再用 0.1%升汞溶液浸泡10 min；用灭菌的吸水纸吸干幼穗表面的溶液，固定幼穗(例如，从穗子底部将镊子插入穗芯)，用灭菌刀片削去籽粒顶部60%，挑出幼胚，选择1～2 mm的幼胚盾片向上排列在培养基上，用于诱导愈伤组织。后续农杆菌菌液的准备、农杆菌侵染愈伤组织、抗性愈伤筛选均按照实验室的操作流程[14]。转基因材料特异鉴定引物ZmDREB2.7-2 F：5′-ACCACCAGACGATGTTCCA-3′和ZmDREB2.7-2 R：5′-GGAATTCCCGATCTAGTAACATAGATGA-CACC-3′，扩增片段长度为850 bp。

1.4 近等基因系的构建与鉴定

选择携带优异等位基因型的玉米自交系CIMBL70、CIMBL92与敏感基因型自交系SHEN5003进行杂交，通过连续回交将其优异等位基因型导入轮回母本SHEN5003中，建立两套耐旱基因的近等基因系(世代BC5F3)。玉米自交系CIMBL70和CIMBL92，携带ZmDREB2.7基因的启动子区5个显著位点具有相同的等位基因型，正与SHEN5003相反。利用InDel-21设计引物进行PCR分型，区分回交单株的ZmDREB2.7基因的等位基因型，ZmDREB2.7-3 F：5′-CGAGGACTGCATTGCTAGCA-3′，ZmDREB2.7-3R:5′-GCGGCGGCACCCGATCCAT-3′，扩增片段长度为70/91 bp。

1.5 ZmDREB2.7转基因和近等基因系植株转录水平的检测

从不少于3棵苗中取样、用液氮速冻，用TRIZOL(北京百泰克生物技术有限公司，Bioteke)法分离出总RNA，紧接着用DNAseⅠ(宝生物(大连)工程有限公司，Takara)法消除基因组的污染，然后用Nanodrop1000(Thermo Scientific product, USA)测定浓度，统一取5 μg进行 0.8%琼脂糖胶。取1 μg总RNA，用重组M-MLV 反转录酶(普洛麦格生物技术有限公司，Promega)，以Oligo(dT)23(Promega)为引物，进行cDNAs的合成。采用荧光定量PCR，以ZmUbi-2(UniProtKB/TrEMBL; ACC:Q42415)为内参，分析ZmDREB2.7的相对表达量。采用ABI公司的实时荧光定量PCR仪器(Stepone Real-Time PCR System)和宝生物染料法荧光定量试剂盒(TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM)完成。最后，以2-ΔΔCt法计算ZmDREB2.7的相对表达量[10]。ZmDREB2.7-4 F：5′-TATGATGATGATGCACTCC-3′，ZmDREB2.7-4 R:5′-GAG-TTGGAAATGGAATCG-3′;ZmUBI-2-1 F:5′-TGGTTGTGGCTTCGTTGGTT-3′，ZmUBI-2-1 R：5′-GCTGCAGAAGAGTTTTGGGTACA-3′。

1.6 近等基因系基因型鉴定

利用CTAB(CTAB提取缓冲液使用前加入1%～2% β-巯基乙醇，并于65 ℃温浴备用)提取亲本和近等基因系基因组，然后通过中玉金标记公司采用Maize56K SNP Array进行扫描。利用Beckman自动工作站进行样品准备；再通过GeneTitan芯片系统完成后续的芯片杂交、洗涤、扫描等一系列步骤。

1.7 玉米苗期抗旱表型分析

将玉米播种于基质(营养土∶蛭石∶草炭 土=1∶1∶1)，每个小红钵播种25粒种子，浇足水分在培养间(16 h-光/8 h-暗，28 ℃/22 ℃，空气湿度60%)进行催芽，7 d后芽出土约2 cm时，选取长势一致的植株移入方盒中种植。每个方盒装入2 kg混合均匀的灭菌基质(营养土∶蛭石∶草炭土=1∶1∶1)，每个方盒种植6行，每行5株，其中左侧3行为对照，右侧3行为转基因或近等基因系植株。正常条件下生长10 d后开始停止供应水分进行干旱处理。停水约25 d后，当对照的干枯程度与转基因或近等基因系植株出现明显差异时开始复水，复水3 d后统计各株系的存活率。一般将叶片返绿植株定义为存活植株，将表现为严重受旱且无法正常生长的植株定义为死亡植株，存活率为各株系存活植株数占总植株数的百分比。试验至少重复3次，取多次试验的均值进行苗期存活率的统计分析。

1.8 玉米转基因植株田间试验

选择WT(A188)及ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-1 和ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10 T4代纯合种子进行田间表型试验。2018年春，在新疆农科院安宁渠试验场进行玉米转基因材料大田干旱试验。所有试验材料于2018-05-15播种，2018-09-10收获，其种植密度为58 000 株/hm2。试验田分3个小区，分别为水区、干旱-1、干旱-2，为排除小区之间灌溉的影响，每个小区之间间隔4 m，并在小区四周铺设0.5 m深的隔水层。小区面积15 m2，每个小区内设3次重复，1行区，3 m行长，行距50 cm，株距25 cm，双粒播保证齐苗(13株/行)。水区在玉米的整个生育期内正常灌溉；干旱-1则在玉米正常生长29 d后停止供水，并在玉米吐丝期(R1期)增加1次灌水；干旱-2则在玉米正常生长15 d后停水供水，并在玉米V7、R1期增加两次灌水。干旱-1和干旱-2供水水量分别为水区的60%、40%[14]。

1.9 统计分析方法

通过Excel 2016记录和整理试验数据。使用SPSS软件(版本17.0)进行数据的单因素方差分析和Duncan’s多重比较。

2 结果与分析

2.1 ZmDREB2.7近等基因系的构建和遗传背景恢复率分析

为比较不同的ZmDREB2.7等位基因的效应，选择2个耐旱型玉米自交系(CIMBL70和CIMBL92)与敏感自交系(SHEN5003)杂交，再连续回交导入轮回母本SHEN5003中，通过特异PCR辅助选择，建立两套耐旱基因的近等基因系。通过Maize56K SNP Array进行扫描，结果如图1所示，NIL-ZmDREB2.7CIMBL70和 NIL-ZmDREB2.7CIMBL92的ZmDREB2.7均恢复到优异等位基因型。NIL-ZmDREB2.7CIMBL70和 NIL-ZmDREB2.7CIMBL92遗传背景恢复率分别是94.96% 和95.11%，其中7号染色体遗传背景恢复率低于平均值，分别是73.64%和73.48%。

2.2 ZmDREB2.7近等基因系的苗期耐旱性鉴定

为了比较ZmDREB2.7不同等位基因型的耐旱性，采用盆栽法进行室内苗期存活率试验(图2-A)，同时检测了用于表型试验的穗子的基因型(图2-B)和表达量(图2-C)。NIL-ZmDREB2.7CIMBL70和 NIL-ZmDREB2.7CIMBL92的表达量均显著高于轮回亲本SHEN5003。NIL-ZmDREB2.7CIMBL70和 NIL-ZmDREB2.7CIMBL92的存活率分别是81.34%和83.33%，显著高于SHEN5003(37.3%，图2-D)。

2.3 玉米转基因的苗期耐旱性表型评价

本研究利用农杆菌介导转化玉米自交系A188幼胚的遗传转化体系将ZmDREB2.7基因导入A188基因型玉米中，通过特异PCR检测和连续自交后，获得T4代纯合株系。采用盆栽法进行室内苗期存活率试验(图3-A)，同时检测了用于表型试验的穗子的叶片表达量(图3-B)。ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-1 和ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10的相对表达量显著高于野生型(A188，图3-B)。干旱处理后，两个纯合株系ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-1 和ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10存活率分别是68.05%和70.83%，显著高于A188(58.33%，图3-C)。

2.4 玉米转基因田间耐旱性表型评价

在大田试验条件下，检测A188和ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-1 和ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10在干旱处理条件下的耐受性(图4)。在正常浇水条件下(WW)，ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10的单株产量显著高于野生型(A188)，小区产量无显著差异。在干旱-1处理条件下(轻度干旱)，ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-1 比野生型的小区产量少减产 37.36%。在干旱-2处理条件下(极端干旱)，ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10比野生型的小区产量少减产22.54%。

3 讨 论

在植物响应干旱胁迫方面，DREB类转录因子起着重要作用，但是关于这些基因的自然变异是否直接影响植物的耐旱性的报道很少。回答这个问题，不仅需要剖析DREB基因的生物学机理，更需要抗逆基因工程中的应用。分子标记辅助选择一般利用分子标记选择育种材料的目标区域，同时筛选全基因组，减少连锁累赘，从而加速获得符合预期的新材料。例如，利用AC7643作为耐旱性的优良供体亲本，改良轮回亲本CML247，通过2轮回交和2轮自交，最后评价改良的CML247分别与CML254和CML274测交系组配的杂交种的耐旱性，比对照和测交种更好，这也是耐旱分子标记辅助选择育种典型应用案例[15]。利用携带的ZmVPP1耐旱基因型自交系CIMBL70和CIMBL91为供体亲本，以携带敏感基因型的自交系SHEN5003为轮回亲本，经过4轮回交和2轮自交的后，NIL-ZmVPP1CIMBL70和 NIL-ZmVPP1CIMBL91的存活率较NIL-ZmVPP1SHEN5003显著提升了30%[14]。本研究构建了ZmDREB2.7的近等基因系材料，在实际生产中评价其优异等位基因型的应用价值。试验结果表明，NIL-ZmDREB2.7CIMBL70和 NIL-ZmDREB2.7CIMBL92的ZmDREB2.7基因型均回复到优异等位基因型，遗传背景恢复率分别是 94.96%和95.11%，表达量均显著高于轮回亲本SHEN5003，存活率分别是81.34%和83.33%，显著高于SHEN5003(图2)。分子标记辅助选择和转基因方法一定程度上加快了育种进程，但如何高效利用少数主效抗性基因到育种实践中，实现分子设计育种还是科学家共同需要面临的难题。利用CRISPR/Cas9技术已经可以实现负效应基因的定点敲除，或者染色体的大片段缺失，或者不良性状相关基因簇的快速敲除，从而大大提高农作物目标性状定向改良效率。

在抗逆基因工程中，启动子的选择一直是转基因工程的瓶颈，因此科学家一直努力鉴定和利用受胁迫诱导的启动子。例如，Shinozaki试验室将DREB1A置入35S(constitutive cauliflower mosaic virus(CaMV35S)和rd29A启动子下转入拟南芥后，转基因植株可以提高植物的抗性；正常条件下，组成型表达DREB1A的转基因烟草株系生长发育延迟、植株矮小，然而rd29A的启动子调控的DREB1A的转基因烟草株系生长旺盛且耐逆性增强[16]。本研究中，ZmDREB2.7转基因材料用的自身启动子，显著提高转基因植株的ZmDREB2.7的表达量。转基因玉米材料ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-1和ZmDREB2.7pro:ZmDREB2.7-10存活率分别是68.05%和70.83%，均显著高于野生型(A188，58.33%)。更重要的是，在2018年新疆大田试验中，2.7-1和2.7-10两个株系均表现较强的耐旱性，在干旱条件下，小区少减产20%以上。本试验中获得的转基因材料目前没开展基因上游和下游方面的相关研究。如果能进一步分析相关的转录调控网络系统，深入探索具体调控细节，解析出抑制环节和促进环节，再利用遗传操作技术进行精准改良，相信会获得较好的效果。

4 结 论

本试验构建了不同等位基因型的近等基因系材料和自身启动子驱动表达ZmDREB2.7的玉米转基因材料。在苗期存活率试验和大田表型调查中，ZmDREB2.7基因可以显著提高玉米苗期的耐旱性、未降低产量，因此该基因是较重要的苗期耐旱基因资源。本试验不足之处在于仅在玉米苗期而未在其他生育时期进行研究，希望以后对玉米的各个生育时期进行试验研究并综合分析进而筛选出更重要的抗旱基因。