外泌体在原发性胆汁性胆管炎中作用的研究进展

马海涛， 唐映梅

昆明医科大学第二附属医院 消化内科， 昆明 650101

原发性胆汁性胆管炎(PBC)是一种以女性发病为主的慢性进行性自身免疫性肝病，其特点是慢性进行性小胆管破坏和肉芽肿性淋巴细胞性胆管炎，具有典型的抗线粒体抗体(AMA)血清反应阳性[1]。PBC发病机制尚未完全明了，更有效的治疗方法还有待研究[2]。如未经规范治疗，PBC可进展为终末期肝病如肝硬化和肝衰竭，需要进行肝移植[3-4]。目前的研究表明，外泌体参与了PBC的发生发展，同时多种干细胞来源的外泌体对PBC疾病可能起到保护和治疗的作用。本文回顾了近年来外泌体及其携带的多种分子在PBC中的作用并作一总结，以此为PBC的发病机制研究及临床应用提供理论依据。

1 外泌体概述

外泌体(exosomes)是一类直径在30～200 nm大小不均的细胞外囊泡，几乎所有类型的细胞都可以生成和分泌外泌体，其广泛存在于人体血液、母乳、胆汁和尿液等多种体液中[5-6]。外泌体是由细胞中的多囊泡内体发育成熟时内膜向内萌发而形成，当多囊泡内体与细胞膜融合时分泌到细胞外的一种腔内囊泡[7]。外泌体内含有多种生物活性分子如蛋白质(过氧化物酶、丙酮酸激酶、跨膜蛋白、脂质锚定内膜蛋白、内周膜蛋白等)、DNA(单链DNA、双链DNA、基因组DNA、线粒体DNA和反转录的互补DNA等)以及RNA[mRNA、microRNA、环状RNA(circRNA)、长链非编码RNA (lncRNA)等]和脂质，它们参与细胞间信号转导并调节各种生理活动[5]。

目前已知外泌体最主要的功能是在邻近和远处的细胞间穿梭以传递不同的信号分子，参与细胞间信号通讯。外泌体通过巨胞饮、吞噬作用、网格蛋白介导的内吞作用和非网格蛋白介导的内吞作用等多种方式被受体细胞摄取后，其内携带的多种生物分子可调控受体细胞内下游的多个信号通路而在调节细胞活化和增殖、代谢、免疫反应和抗病毒反应等方面发挥重要的生物学功能[5,7-8]。此外，外泌体还可以转移Ⅰ类、Ⅱ类主要组织相容性复合体和抗原，具有抗原呈递功能[9]。

作为一种细胞间的通讯媒介，外泌体不仅在机体正常的生理稳态中发挥作用，而且在感染性疾病、代谢性疾病和癌症等多种疾病的发病和进展中也饰演着重要的角色[8,10]。随着生命科学和医学探索的不断深入，外泌体在自身免疫性疾病中的相关研究逐渐成为当前医学领域的一大热点，其在PBC疾病中的研究也有了一些重要的进展。

2 外泌体在PBC疾病中的作用

大量研究[11-12]表明，外泌体具有诱导抗原特异性免疫和引发炎症反应的功能。来自不同细胞群体的外泌体可以在不同个体的免疫微环境中介导免疫激活或免疫抑制从而在自身免疫性疾病的免疫反应中发挥不同的作用。PBC是一种典型的以肝脏发生病理生理改变为主的器官特异性自身免疫性疾病,对PBC相关外泌体的深入研究可能有助于PBC发病机制的进一步阐明。

2.1 循环外泌体可调节APC共刺激分子的表达 已有多项研究[13]证实，抗原递呈细胞(APC)可诱导自身反应性T淋巴细胞分泌多种炎症因子维持PBC肝脏炎症，并可介导PBC胆管损伤。Tomiyama等[14]在对PBC患者和正常人外周血单个核细胞(PBMC)的分析中发现，血液循环中存在的外泌体可显著增加CD14+单核细胞表面CD86分子的表达，同时，CD40分子在CD11c+树突状细胞上的表达增加，而在B淋巴细胞上的表达降低(图1a)，但PBC患者体内的循环外泌体并不能诱导外周血中的单核细胞产生炎性因子。CD40和CD86是循环外泌体诱导的PBC免疫应答过程中APC活化的两个关键共刺激分子，循环外泌体通过调节这两个分子在APC亚群中的表达而影响APC活化。这些结果表明，循环中的外泌体对单核细胞功能的调控作用是通过调节细胞共刺激分子表达的改变而不是诱导细胞分泌炎性因子产生的。此外，研究发现外泌体中含有PBC疾病的主要自身抗原PDC-E2，可能随外泌体进入细胞后被细胞加工进一步参与PBC中APC的活化。

研究者还在PBC患者和健康对照者的循环外泌体中筛选出了18个差异表达较为显著的miRNA，其中miRNA-451a和miRNA-642a-3p的水平明显升高，表明外泌体中的miRNA可能参与PBC疾病进程中调节APC上共刺激分子的表达[14]。近年来研究[15-16]提示miRNA-451a与多种自身免疫性疾病的发生发展相关，但目前尚未见miRNA-642a-3p在自身免疫性疾病中的相关报道。然而，这两个miRNA水平上调的程度与PBC病情的进展无关，可能与该项研究的患者正在接受熊去氧胆酸的治疗有关，需要更多的研究来确定外泌体miRNA水平是否与PBC疾病的严重程度相关。

2.2 胆管细胞来源的外泌体可介导生物分子向肝内细胞转移

越来越多的研究[6,17]表明，外泌体介导的各种生物大分子的转移与多种肝脏疾病有着密切的关系。此前一项研究[18]表明衰老的胆管细胞可释放大量的外泌体，这些含有多种生长因子的外泌体进入正常胆管细胞和巨噬细胞等靶细胞后可改变这些靶细胞表型而影响胆汁淤积性肝损伤。

lncRNA H19(简称H19)是目前研究最广泛的lncRNA，位于人类第11号染色体上。生理条件下，H19在除骨骼肌外的几乎所有组织中均下调，H19的异常表达常常与包括PBC在内的多种肝脏疾病密切相关[19]。Li等[20]研究发现，在胆汁淤积条件下，雌激素和牛磺胆酸通过其同源受体诱导ERK1/2信号通路的激活而上调胆管细胞中H19的表达并促进携带了H19的外泌体的释放，携带H19的外泌体直接或通过血液循环被肝脏内的细胞摄取后抑制肝脏细胞中小分子异二聚体伴侣的表达进而导致胆汁酸合成增加，最终加重淤胆性肝损伤。该团队进一步发现，肝星状细胞(HSC)和HSC来源的成纤维细胞是胆管细胞来源外泌体最主要的靶细胞。PBC小鼠模型中的所有肝脏实质细胞和非实质细胞中，HSC摄取的胆管细胞来源的外泌体最多，进入细胞的外泌体H19可调节HSC的G1/S细胞周期转变，对HSC的激活和增殖起着关键的促进作用(图1b)，进而参与PBC疾病肝纤维化的发生发展[21]。然而，外泌体H19介导的HSC激活的潜在机制仍有大部分未知，需要更深入的研究以阐明。

众所周知，Kupffer细胞和单核细胞来源的巨噬细胞激活后会产生多种细胞因子和趋化因子，在PBC的胆管损伤和肝脏炎症中起着重要作用[13,22]。胆管细胞来源的外泌体H19可被驻留在肝脏内的Kupffer细胞摄取，诱导Kupffer细胞激活并向M1方向极化，刺激Kupffer细胞分泌趋化因子配体2(CCL-2)和IL-6并通过CCL-2/CCR-2信号通路促进单核细胞来源的巨噬细胞活化、迁移及M1极化和炎症细胞浸润(图1b)，促进PBC疾病肝脏炎症的发展[23]。

3 外泌体在PBC临床诊疗中的作用

PBC病因未明，缺乏明确的早期非侵入性诊断和预后判断的手段，同时也缺乏足够的治疗靶点和特异性的治疗药物。因此，寻找诊断和治疗PBC的新方法仍是未来临床和基础研究的首要任务。随着外泌体提取、保存及检测技术的日益更新，外泌体在各种疾病中的应用前景也越来越广阔[24-25]。外泌体存在于几乎所有体液中，因其有脂质双分子层可在血清中处于相对稳定状态，且外泌体含有来源于细胞的组织特异性蛋白和核酸，其数量和含量可随着疾病状态的不同而变化，有望成为一种新型诊疗方法[26]。

3.1 外泌体可能是PBC潜在的诊断标志物

建立准确度高、特异性强、安全性好的早期诊断方法是防治PBC的关键环节之一。目前临床中诊断PBC的特异血清学指标为AMA，然而，多项研究[27]指出AMA阳性与PBC疾病的严重程度和预后无关，且5%～10%的PBC患者血清AMA阴性，此类患者无核心诊断指标。一些外泌体本身以及外泌体含有的多种ncRNA已被确定为多种肝病潜在的诊断标志物，如病毒性肝炎、药物性肝损伤、酒精性肝病、肝细胞癌和胆管癌[8]。也有一些研究提示外泌体及其携带的多种核酸分子可能在PBC诊断和预后中有一定的应用价值。

3.1.1 外泌体microRNA(miRNA) miRNA是一类长度为20～24个核苷酸组成的高度保守的非编码小RNA，参与多种基因表达转录后水平的调控，在细胞的增殖分化、代谢和凋亡等过程中发挥关键的激活或抑制作用[28]。外泌体固有的脂质双分子层具有较好的稳定性可使外泌体中携带的miRNA分子不易被降解，因此常常被认为是理想的疾病活动性和预后判断的生物标志物[29]。

大量研究[30]证实了外泌体和miRNA可以作为潜在的非侵入性生物标志物准确地识别、预测和治疗包括PBC在内的多种胆道疾病。目前已经发现多个 miRNA 在 PBC患者和正常人的血清以及PBMC中差异表达，呈现出PBC特异的血清学miRNA 表达谱，在众多差异表达的外泌体miRNA中，外泌体miRNA-506可能对PBC患者的诊断和预后有重要的潜在应用价值[2,9]。近期有研究[31]发现在AMA阴性PBC患者血清中miR-21和miR-150的表达显著增强，并且与患者的血清AMA抗体滴度呈负相关，miR-21和miR-150及其下游靶基因的显著改变可能是AMA阴性PBC患者的特征性表现。这些研究结果显示，多种外泌体miRNA可能参与PBC进程，检测PBC患者血清和尿液中的外泌体miRNA有可能成为PBC疾病的早期非侵入性诊断和预后判断的一种方法。然而，外泌体miRNA在PBC疾病诊断中的研究仍处于早期的临床前阶段，与真正应用到临床诊断中还有很大的差距。

3.1.2 外泌体lncRNA lncRNA是一类长度超过200个核苷酸而不具备编码蛋白质功能的RNA，可在不同水平上调控基因表达，在机体的生理和病理活动中发挥重要作用[32]。然而，lncRNA的稳定性较差，很容易被血液中的RNase降解，因此很难直接检测到血液中的lncRNA，循环中的外泌体可以保护lncRNA不被降解进而放大lncRNA作为诊断标志物的潜能[33-34]。

不同来源的外泌体lncRNA与各个系统的多种良性疾病和恶性肿瘤的发生发展密切相关，可作为一种无创的临床诊断和预后评价的标志物[35-37]。一项基因组研究[38]发现lncRNA共有38个单核苷酸多态性位点与PBC密切相关，其中21个位点也与其他自身免疫性疾病相关。另有研究[39]发现lncRNA AK053349在PBC患者PBMC中表达增加，并与Mayo风险评分呈正相关，可能在PBC发病中有潜在作用。最近的研究[21]发现，PBC患者血清外泌体lncRNA H19水平在晚期肝硬化患者中显著上调并与肝脏H19水平和胆汁淤积性肝损伤的肝纤维化程度密切相关，提示循环外泌体H19水平可能是PBC临床诊断的潜在血清标志物和预后评估的重要指标，但其敏感性和特异性还需进一步研究加以验证。这些研究结果表明外泌体lncRNA可能是PBC疾病的潜在生物标志物，为外泌体lncRNA在临床诊断中的应用提供了理论基础。

3.2 外泌体在PBC治疗中的研究 熊去氧胆酸(UDCA)是目前治疗PBC疾病的一线用药，但仍有约40%的患者服用UDCA的疗效不佳，迫切需要寻找一些新的治疗方法来控制此类患者的病情[2]。由于外泌体在人体内的生物相容性较好且体液中的外泌体具有天然的稳定性和靶向性，其本身或作为靶向治疗药物的载体在疾病治疗中的研究也越来越广泛[10,40]。

间充质干细胞具备独特的自我更新能力和多向分化潜能受到研究者的广泛关注，但因其安全性备受争议而限制了它在临床中的应用。间充质干细胞来源的外泌体富含生物活性分子，更易生产和储存，没有活细胞而不具有成瘤风险,可作为一种理想的无细胞疗法提供一些新的治疗策略[41]。肝纤维化被认为是包含PBC在内的各种肝病中晚期共同出现的病理变化，有研究[42]发现，人骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来控制HSC的活化增殖进而减轻肝纤维化小鼠模型的纤维化程度，此外，人骨髓间充质干细胞来源的外泌体还可抑制肝脏炎症和促进肝细胞再生。大量研究证实胆管上皮细胞衰老是PBC疾病重要的病理改变之一， Chen等[43]采用氧化应激(H2O2)诱导胆管细胞衰老后与人胎盘间充质干细胞(Hpmsc)来源的外泌体共培养后发现，Hpmsc来源的外泌体可通过调节细胞周期相关抑制衰老的蛋白p21WAF1/-Cip1和p16INK4a以及减少衰老相关分泌表型组分和趋化因子的表达从而延缓胆管细胞衰老的进程并促进胆管细胞增殖衰老而产生保护作用。这些研究结果对寻找PBC疾病治疗的新方法具有重要意义，虽然目前外泌体尚未应用于临床诊疗，但是随着探索的不断深入，外泌体可能在不久的将来成为治疗PBC疾病的理想工具。

4 小结与展望

综上所述，各种来源的外泌体及其携带的不同生物分子在PBC疾病的各个阶段中有着不同的作用并有望发展为PBC早期诊断、预后评价和精准治疗的无创性工具。虽然近几年关于外泌体与PBC疾病的研究取得了许多进展，但外泌体在PBC发生发展中的分子机制仍需进一步探索，外泌体的分泌和定向细胞摄取的机制尚不明了。此外，标准化、高通量分离和提取外泌体的方法仍处于探索阶段，这些问题给外泌体在PBC疾病中的临床应用带来了极大的挑战。目前有关外泌体在PBC疾病中的研究还有许多问题有待阐明，但随着研究的不断发展和技术的日益更新，外泌体将会为PBC疾病的发病机制探索和临床诊疗带来更多的新思路和新方法。

利益冲突声明：所有作者均不存在利益冲突。

作者贡献声明：马海涛负责起草文章，对行文的思路和设计有关键贡献；唐映梅参与了修改文章关键内容。