细胞因子在慢性乙型肝炎治疗中的研究进展

高子翔， 沈忠良,2， 刘 晶,3， 谢幼华,4

1 复旦大学教育部/卫健委/医科院医学分子病毒学重点实验室， 上海医学院基础医学院病原生物学系，上海 200032； 2 复旦大学附属华山医院 感染科， 上海市传染病与生物安全应急响应重点实验室，国家传染病医学中心， 上海 200040； 3 复旦大学 生物医学研究院， 上海 200032；4 上海市重大传染病和生物安全研究院， 上海 200032

HBV感染可引起急、慢性乙型肝炎(CHB)，肝纤维化，肝硬化和肝癌等肝脏疾病。HBV是一种基因组约为3.2 kb的部分双链环状DNA(relaxed circular DNA, rcDNA)的包膜病毒。成熟的HBV颗粒也称为Dane颗粒：内含由核心抗原(HBcAg)组装成的二十面体核心颗粒，核心颗粒内主要为rcDNA以及与其共价偶联的病毒聚合酶；宿主来源的脂质包膜上嵌有不同比例的乙型肝炎大、中、小表面抗原(large/middle/small hepatitis B s antigen, L/M/S HBsAg)。目前对HBV感染肝细胞的过程已有初步的认识。首先HBV特异性识别肝细胞膜上的钠离子-牛黄胆酸钠共转运蛋白受体并通过内吞的方式进入肝细胞；随后核心颗粒携带rcDNA进入细胞核，并通过特殊的修复机制形成共价闭合环状DNA(cccDNA)；最后cccDNA作为转录的模板启动HBV的基因表达和复制。细胞核内cccDNA能够与组蛋白和非组蛋白等因子组装为微小染色体，其稳定存在于细胞核内是CHB患者难以治愈的关键原因。

机体免疫反应同HBV的清除或持续性感染密切联系。大量研究表明，急性感染中某些细胞因子的分泌水平与HBV特异的杀伤性T淋巴细胞活化相关；而在慢性感染中，某些抑制性细胞因子参与HBV特异性免疫细胞的耗竭，进而无法有效清除病毒。因此通过对各类细胞因子功能研究将有助于为抗病毒治疗提供新的候选靶点。

1 白细胞介素(IL)

IL包括多个家族，主要由免疫细胞所产生，是一类能够调控细胞免疫与体液免疫的细胞因子。

1.1 IL-1家族 IL-1是一种炎症细胞因子, 包括IL-1α和IL-1β。在一项研究[1]中发现，CHB患者血清中IL-1水平远高于非HBV感染者，而用HBV体外刺激非HBV感染者的外周血单核细胞能明显提高IL-1的分泌，表明HBV慢性感染可能促进IL-1表达/分泌；但当HBV病毒载量达到一定水平时，反而降低血清中IL-1的水平，表明HBV对IL-1的表达/分泌的调控具有双重性。有关IL-1抗HBV感染的研究主要集中于IL-1β。在体外实验中，乙型肝炎e抗原(HBeAg)通过抑制IL-1β激活的NF-κB信号通路，增强HBV复制；在对干扰素α(IFNα)治疗无应答的CHB患者中，IL-1β的分泌水平被显著抑制[2-3]；在体外感染模型中，IL-1β能够显著抑制不同基因型的HBV RNA水平[4]。上述研究表明HBV可能通过抑制IL-1β的抗病毒效应来维持病毒的持续感染，而IL-1β可能作为一种潜在的抗HBV治疗候选分子。

IL-18是参与辅助性T淋巴细胞(Th)1和2型免疫平衡调节的多功能细胞因子。IL-18最初是在研究IFNγ的诱生过程中被发现的，与IL-1具有相似的生物学特性。研究[5]表明在小鼠模型上，IL-18能够与IL-12协同诱导IFNγ产生，进而抑制HBV；另一方面，HBeAg可拮抗IL-18介导的信号通路抑制IFNγ分泌，可能有助于维持HBV持续感染；研究[6]发现低水平的IL-18不能有效诱导IFNγ的产生，从而导致孕鼠体内Th1/Th2细胞免疫失衡，造成宫内HBV持续感染，这些证据表明，IL-18的高表达有利于病毒的清除。但是过高表达的IL-18可以加重肝损伤，具有潜在的治疗风险[7]。因此，阐明IL-18与抗HBV感染、肝损伤三者间的相互关系，明确IL-18的有效作用浓度、给药频次等，将有助于推动IL-18在抗HBV感染中的临床转化。

IL-33作为警报信号蛋白而广泛存在于多种组织和细胞中，并在应激条件下可分泌出胞，参与机体的炎症反应。有研究[8]表明，IL-33能够通过激活滤泡辅助性T淋巴细胞进而提高抗HBV的体液免疫水平；另一方面，病毒性肝炎中IL-33与其膜上受体ST2表达水平的升高常与肝纤维化发展进程相关。本课题组前期研究[9]发现，基于尾静脉高压水动力注射的HBV急性小鼠模型血清中 IL-33的表达水平显著高于慢性小鼠。为进一步研究IL-33是否具有抗病毒治疗潜能，将IL-33的过表达质粒注射到CHB小鼠，发现IL-33可以清除血清及肝内HBV抗原和DNA，同时也检测到肝内大量免疫细胞的聚集。这些研究结果表明IL-33可促进HBV特异性Th1和Th2免疫反应水平，同时也可能与肝脏疾病进程相关。此外，近期也有体外研究[10]发现IL-33能够直接抑制HBV基因的表达，但是具体机制仍待进一步探究。

IL-36包括促炎因子IL-36α、IL-36β、IL-36γ和天然受体拮抗剂IL-36Ra。这些促炎因子共用同一受体IL-36R，并在多种疾病的炎症和纤维化进程中发挥作用。Gong等[11]发现CHB患者血清中的IL-36α水平与HBV病毒载量呈正相关性。由于该研究样本量较少，因此IL-36与HBV的关系仍待验证和阐明。

IL-37是一种由多类细胞产生并分泌的抗炎症因子，IL-1家族的新成员。研究[12]表明CHB患者经替比夫定治疗后，其HBeAg血清学转化中伴随IL-37水平的降低，推测IL-37可能参与抗HBV免疫反应。但其是否在抗HBV中发挥作用仍需要更多研究来明确。

1.2 IL-2家族 IL-2是一种促进炎症反应的T淋巴细胞生长因子，在调节免疫反应过程中发挥重要作用，能够增强T淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)的杀伤活性，也能维持调节性T淋巴细胞(Treg)的功能等。早在20世纪，IL-2就被批准应用于癌症治疗，但是其严重的副作用令患者饱受困扰。研究[13]发现，在CHB感染中，特异性CD4+T淋巴细胞的耗竭是导致IL-2分泌减少的重要原因，可能是HBV免疫耐受机制中的重要一环。因此，研究人员对IFNα治疗无应答的CHB患者给予低剂量的IL-2序贯治疗，发现该方案能够显著活化HBV特异性T淋巴细胞并提高HBeAg血清学转化率[14]。此外，曾报道有研究者[15]尝试对1例HBV相关肝硬化患者使用低剂量的IL-2进行免疫治疗，并取得一定的疗效。这些结果表明，虽然IL-2在临床治疗应用中可能有一定的风险，但通过优化治疗方案(如优化IL-2的注射剂量、频次、患者入选标准)，可能为CHB患者提供一种新的治疗选择。

IL-4主要由Th2分泌，通过促进Th2分化且抑制Th1反应，参与体液免疫与细胞免疫调节。研究[16]表明CHB患者血清中IL-4的水平显著低于非感染人群，但在接受抗病毒治疗后，血清中IL-4水平显著升高并伴随HBV DNA载量降低。此外，在肝癌细胞系中，IL-4可显著抑制HBV的基因表达和复制[17]。但也有一些证据[18]显示，IL-4可能有利于HBV的持续感染。因此，IL-4在HBV持续感染中可能具有双重作用，仍然需要进一步的研究，阐明具体机制。

IL-15是一种调控NK细胞、NKT细胞以及CD8+T淋巴细胞功能和稳态的细胞因子，具有抗肿瘤和抗病毒的作用。IL-15能够显著增加特异性CD8+T淋巴细胞，同时IL-15水平也与NK细胞功能恢复存在一定的正相关性；在小鼠模型中，肝内过表达的IL-15能够以IFNβ依赖的方式抑制HBV复制[19]；IL-15也可与IFNα协同增强特异性CD8+T淋巴细胞功能，进而发挥抗病毒作用[20]。上述结果表明IL-15具有活化抗HBV的特异性和非特异性免疫反应，特别是增强抗HBV细胞免疫的活性。

IL-21主要来自于滤泡辅助性T淋巴细胞、Th17以及NKT细胞，其受体广泛分布于多种细胞，具有调节B淋巴细胞、CD4+和CD8+T淋巴细胞活性，发挥抗肿瘤和抗病毒等多种功能。笔者前期研究[21]发现，急性HBV小鼠模型血清中IL-21水平显著高于慢性HBV小鼠；将IL-21表达质粒注射到慢性HBV小鼠后可清除体内HBV，提示IL-21具有抗HBV治疗的潜在可能性。进一步将携带IL-21基因的腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)基因治疗载体(AAV-IL-21)注射到数种CHB小鼠模型，结果表明AAV-IL-21具有良好的治疗效果，并揭示IL-21主要是通过活化杀伤性CD8+T淋巴细胞而发挥抗HBV功能。也有报道[22]显示，IL-21通过逆转CD8+T淋巴细胞耗竭状态，加速HBsAg的清除而发挥抗病毒作用。这些研究均表明IL-21具有作为新的治疗HBV候选分子的潜能。但是值得注意的是IL-21对HBV的清除与年龄有关[23]，同时持久性高水平IL-21可能导致HBV相关的肝损伤[24]。因此，需优化精准个体治疗方案，避免或降低治疗过程中的不良后果及风险。

1.3 IL-6/12家族 IL-6是单核细胞活化后产生的一种多效的细胞因子，同时具备促炎和抗炎活性。研究[25]表明CHB患者血清中IL-6水平显著高于非感染人群，并且高水平IL-6可促进肝细胞癌增殖，因此与不良预后有关。但是也有研究[26]显示，IL-6能够显著抑制cccDNA转录活性，降低HBV复制。因此，IL-6的多效性在HBV治疗中可能是一把双刃剑，对其应用的推进仍需要开展更深入的研究工作。

IL-12是一种由树突状细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞等免疫细胞分泌的炎症因子，具有促进幼稚T淋巴细胞向Th1分化、调节细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和NK细胞的杀伤能力等功能。在急性HBV患者中，血清IL-12水平显著升高；而在CHB患者中，IL-12表达水平较低，提示IL-12可能具有抗HBV功能[27-28]。在CHB小鼠模型上，采用IL-12与乙型肝炎疫苗联合疗法，发现IL-12能够“打破”HBV特异性CD4+T淋巴细胞的免疫耐受，激活特异性CD8+T淋巴细胞反应，实现HBV清除，且在部分小鼠可实现HBV表面抗体(抗-HBs)血清学转化[29]。相关研究[30]也进一步证实IL-12具有恢复HBV特异性CD8+T淋巴细胞的抗病毒功能。这些证据都显示IL-12在CHB治疗中具有潜在的应用前景。

IL-27是一种主要由活化的树突状细胞和巨噬细胞分泌，并在固有免疫和适应性免疫中发挥重要作用的多效型细胞因子。在HBV感染中，研究[31]发现IL-27可促进IFNλ1表达，进而抑制HBV的基因表达和复制；也有研究[32]表明IFN刺激基因(IFN-stimulated gene，ISG)三基序蛋白25(tripartite motif 25，TRIM25)能显著抑制HBV，在此过程中IL-27也发挥关键作用，因此IFN-IL-27-TRIM25信号轴可能是新的抗病毒靶点。此外，在适应性免疫方面，研究[33]揭示IL-27能够有效增强B淋巴细胞免疫反应，改善总抗体产生能力及提高针对HBsAg的IgG和IgM分泌量，进而显著降低血清中HBsAg和HBV DNA水平。但IL-27在HBV感染的免疫中也可能通过发挥促炎作用造成肝损伤。所以在临床转化前，需深入探究IL-27的作用机制，据此优化CHB的治疗方案。

1.4 IL-10家族 IL-10作为一种重要的免疫调节因子，主要具有抑制促炎因子分泌、终止炎症反应以及促进B淋巴细胞分化产生抗体的能力。目前研究认为IL-10可通过抑制过度免疫反应，起到保护机体的功能，但也能抑制病原体清除，进而造成病原体持续感染。在HBV慢性感染过程中，血清中IL-10的异常升高与HBV DNA载量和肝脏炎症相关，这可能是引起HBV慢性化甚至促进纤维化进展的重要原因之一；值得注意的是，在淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染的小鼠模型中，通过拮抗阻断IL-10受体可促进病毒清除[34]。上述研究提示通过阻断IL-10受体，抑制IL-10的功能发挥有可能遏制HBV慢性感染。

1.5 IL-17家族 IL-17主要由Th17产生并分泌，具有促进炎症反应的功能。与其他促炎因子相似，在HBV感染中，IL-17与肝损伤、肝硬化及肝细胞癌的发生密切相关。在CHB感染中，IL-17的分泌异常将加重炎症反应，促进肝纤维化、肝硬化等[35]。由此可见，IL-17在HBV相关疾病进展中发挥了关键作用。体外实验[36]表明，IL-17具有通过提高黏病毒抗性蛋白A和人寡聚腺苷酸合成酶的表达进而抑制HBV复制的能力，上述研究尽管提示IL-17具有抗HBV活性，但是考虑到其在体内可诱导肝病进展，将其应用于抗病毒治疗应谨慎。

2 集落刺激因子(colony stimulating factor，CSF)

CSF家族主要包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage-CSF，GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte CSF，G-CSF)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage CSF，M-CSF)。GM-CSF具有诱导树突状细胞成熟、分化以及促进抗原递呈细胞的呈递能力，因此被用作抗肿瘤或抗病毒的免疫治疗佐剂。Wang等[37]发现HBV转基因小鼠经GM-CSF预处理后再接种乙型肝炎疫苗，可打破免疫耐受状态，激活HBV特异性体液免疫(HBsAg血清学转化)和CTL反应，促进病毒清除。需要注意的是，GM-CSF的不当使用也可能会导致免疫抑制反应。对GM-CSF抗病毒机制及安全性的深入研究有可能推动GM-CSF组合乙型肝炎疫苗的治疗方式进入临床转化。

3 干扰素(IFN)

IFN自发现以来，已成为一种被广泛应用的抗病毒治疗药物。IFN家族主要分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型IFN：Ⅰ型IFN主要包括IFNα和IFNβ，Ⅱ型IFN为IFNγ，Ⅲ型IFN包括IFNλ1、IFNλ2、IFNλ3和IFNλ4。

大量的研究已经证实尽管存在一定副作用，IFNα在CHB患者治疗中具有良好的抗病毒效果，特别是聚乙二醇(PEG)修饰进一步延长了体内IFNα的生物学活性，使得PEG-IFNα成为临床上主要的抗病毒药物之一。IFNα的抗HBV作用不仅涉及众多的免疫调控反应，也涉及到肝细胞内的直接抗病毒过程。IFNα可通过诱导ISG的表达，从而抑制HBV的基因表达和复制。在一项体外感染实验[38]中，研究发现高剂量的IFNα除了可以有效抑制HBV，还能够引起cccDNA发生脱氨基反应，形成无嘌呤无嘧啶位点(AP位点)后被核酸内切酶降解。因此IFN是少数能够直接降解cccDNA的细胞因子，但该作用是在过高剂量下的体外实验系统观察到的，这意味着该研究仍处于前期研究阶段。另一方面，在小鼠模型及患者中，IFNα通过发挥免疫调节作用，激活NK细胞、HBV特异性B淋巴细胞和T淋巴细胞等效应，最终实现HBV清除。

IFNα具有许多亚型，不同亚型展现出了不同程度的抗病毒和抗细胞增殖等生物学功能。Chen等[39]研究发现IFNα14在体外和小鼠模型内均表现出最优的抗HBV效果，该工作为优化IFNα的抗HBV治疗提供了新选项。此外，IFNα还可同临床一线药物核苷(酸)类似物联用，提高抗病毒治疗效果。另一方面，虽然IFNα在抗病毒治疗中具有良好的效果，但是治疗前需要评估潜在的风险和不良反应，并根据不同患者特征制订个体化治疗方案以期达到更好的临床治疗效果，并降低副作用。

除了Ⅰ型IFN外，Ⅱ和Ⅲ型IFN也具有类似的抗HBV功能，如Ⅱ型IFN能诱导脱氨基作用降解肝细胞内的cccDNA，也能诱导活化HBV特异性T淋巴细胞促进HBV清除[40]；Ⅲ型IFN也可通过诱导肝细胞产生ISG，进而抑制HBV的基因表达和复制[41]。

4 转化生长因子β(TGFβ)

TGFβ主要包括TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，在调控免疫系统和抗病毒感染中发挥双重作用。一方面，TGFβ可以增强Treg活性介导抗炎作用；另一方面，TGFβ促进Th17分化并分泌促炎因子。许多证据表明HBV感染能够提高TGFβ的表达，促进细胞外基质沉积，进而破坏肝脏结构引起肝损伤。但也有研究[42]表明，TGFβ通过激活脱氨基反应诱导病毒cccDNA的降解。深入研究TGFβ的抗病毒机制或许对TGFβ应用于CHB治疗具有指导意义。

5 趋化因子

趋化因子是一类小分子蛋白，能够促进白细胞、内皮细胞和上皮细胞的定向运动，参与肿瘤转移、慢性炎症以及自身免疫性疾病等。趋化因子主要包括CXC家族、CX3C家族、CC家族和C家族，其中同HBV关系最密切的是CXC家族。Yoshio等[43]发现，在HBV急性感染的人和黑猩猩中， 血清中CXC配体(CXC-ligand，CXCL)9、CXCL10、CXCL11和CXCL13的水平显著升高而在CHB患者中则未观察到，值得注意的是，患者在抗病毒治疗中，随着HBsAg血清学的转化可观察到CXCL13的升高，推测CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL13的水平与HBsAg血清学转化有关；此外，肝脏中CXCL13的高表达有利于淋巴细胞浸润，为CD8+T淋巴细胞的抗病毒反应提供有利的微环境[44]。除了CXC家族，最近一项研究[45]发现在小鼠模型中，CC配体9可以活化HBV特异性CD8+T淋巴细胞加速HBV清除。综上，趋化因子可能参与介导抗HBV的特异性免疫反应，并且部分成员可能作为CHB治疗的靶点。总体上，目前对于趋化因子在HBV感染中作用的研究尚不充分。

6 小结

HBV持续感染仍是全球范围内的一个重大公共卫生问题，每年约有60万人死于HBV相关的肝脏疾病，因此急需研发新的抗病毒治疗策略和药物，提高临床治愈率。鉴于在CHB过程中，HBV cccDNA长期存在于肝细胞中，且人体免疫系统受到病毒的压制，因此适度提高免疫系统功能可能是治疗HBV最有效的手段。但是，目前对于大多数细胞因子在HBV慢性感染中作用的认识仍不深入，还未充分阐明涉及的生理与病理作用机制。此外，大多数细胞因子具备多种生物学功能，如具有抗病毒功能的同时也加速肝脏疾病进展，或者细胞因子的不同水平呈现出截然不同的抗病毒或促进病毒复制的活性，因此不能对各种细胞因子的抗HBV作用进行简单的定义和划分。目前需要对于不同类型的细胞因子进行更全面的分析研究，鉴定出在体内有潜在治疗价值的细胞因子。对于准备进入临床转化阶段的细胞因子，在临床试验中应结合CHB患者具体的病毒学指标和疾病进展情况，确定受试患者，制订个性化治疗方案。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：高子翔、沈忠良负责查找文献，分析资料，撰写文稿；谢幼华、刘晶负责确定写作思路，指导文章撰写及最终修改定稿。