从HBV cccDNA角度谈乙型肝炎的功能性治愈

陈 娟， 黄爱龙

重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室， 重庆 400016

HBV感染是我国最为重要的公共卫生问题之一，虽然我国乙型肝炎流行程度大大降低，但是现存感染者和患者数量依然庞大。现有乙型肝炎治疗药物仅能使极少慢性乙型肝炎(CHB)患者达成功能性治愈，即使最有效的组合疗法，HBsAg年阴转率也难以超过2%。实现CHB治愈的关键，在于有效抑制或清除HBV在细胞内形成的高稳定性遗传物——微染色体样共价闭合环状DNA(cccDNA)[1]。

现阶段正在研发的抗病毒药物包括病毒进入抑制剂、衣壳抑制剂、HBV聚合酶抑制剂、HBV X蛋白(hepatitis X protein，HBx)靶向药物、HBsAg抑制剂、RNA干扰(RNAi)类药物，靶向HBV生命周期的不同环节[2-3]。虽然上述部分抗病毒药物可通过有效阻断肝细胞发生再感染或病毒复制从而切断cccDNA生成途径，但遗憾的是，目前尚未见直接靶向cccDNA使之永久失活或清除的药物[4]。

研究cccDNA合成、转录和稳定性调控机制，并在此基础上开发出靶向cccDNA的有效药物是实现乙型肝炎治愈的重大科学问题。本文将简要回顾cccDNA基础研究领域的进展，重点围绕cccDNA沉默或清除策略介绍在研乙型肝炎新药并进行讨论。

1 cccDNA的生物学特征

1.1 cccDNA的形成机制 HBV属于嗜肝DNA病毒，其通过与肝细胞膜上受体牛磺胆酸钠离子共转运多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)结合并进入肝细胞[5]。随后病毒基因组部分环状双链DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)释放入细胞核，并修复为cccDNA，具体包括3个环节：(1)去除rcDNA负链5′端共价结合的病毒P蛋白以及5′-flap结构；(2)去除rcDNA正链5′端RNA引物并补齐不完整的正链；(3)连接正负链末端缺口。体外生化体系的研究[6-7]显示，rcDNA修复为cccDNA至少需要包括瓣结构特异性核酸内切酶1(FEN1)、人增殖细胞核抗原(PCNA)、复制因子C复合物(RFC)、DNA聚合酶δ(Polδ)和ATP依赖性DNA连接酶Ⅰ(LIG1)5个因子参与。cccDNA的形成是HBV侵入细胞后在细胞内进行复制的起始步骤，也是建立病毒感染状态的最重要标志[8]。

1.2 cccDNA的转录调控机制 cccDNA转录是HBV完成生活周期的关键环节之一，其转录受到宿主因子和病毒蛋白的双重调控。靶向cccDNA转录是提高乙型肝炎功能性治愈率的重要手段。目前，研究较为明确的是，有多种普遍分布的转录因子(TBP、AP-1、Sp1、NF-1、CREB等)和肝组织富集转录因子(HNF1、HNF3、HNF4、C/EBP、PPARα等)可结合于HBV基因组增强子或启动子区域，并调控HBV的转录过程[9-11]。近年来，参与DNA甲基化和组蛋白修饰的宿主因子在cccDNA转录活性中的作用逐渐被揭示。研究[12]表明，DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT2、DNMT3)通过作用于HBV基因组中的CpG岛导致cccDNA高度甲基化，抑制其转录活性；组蛋白乙酰基转移酶p300、CBP、HAT1等可增加 cccDNA组蛋白乙酰化水平，增强cccDNA转录活性，相反，组蛋白去乙酰化酶HDAC1、HDAC11则降低cccDNA组蛋白乙酰化水平并抑制其转录活性[13-14]；除此之外，多种蛋白甲基转移酶如SETDB1、PRMT1、PRMT5等也被证实通过调控cccDNA组蛋白甲基化水平增强或减弱cccDNA转录功能[15-16]。本课题组也发现组蛋白去乙酰化酶SIRT3可协同组蛋白甲基转移酶SETD1A和SUV39H1抑制cccDNA转录[17]。近年来，随着高分辨质谱分析技术的进步，巴豆酰化、琥珀酰化、丙酰化、丙二酰化、丁酰化等多种新型组蛋白修饰类型相继被发现[18-22]。这些发现为进一步拓展对cccDNA微染色体表观遗传修饰类型的认识提供了依据，同时也将为发展表观遗传治疗等新型抗病毒策略奠定基础。

随着对宿主因子在cccDNA转录调控中作用的认识逐渐深入，病毒蛋白HBx也被证实对cccDNA转录的起始和维持发挥关键作用。研究[23]表明，当HBx存在时，组蛋白乙酰基转移酶PCAF/GCN5和CBP/p300被募集到cccDNA，而蛋白去乙酰化酶HDAC1和SIRT1与cccDNA的结合减少，激活cccDNA的转录；HBx缺失时，组蛋白甲基转移酶SETDB1和PRMT1等结合到cccDNA，并导致cccDNA转录活性下降[24]。此外，HBx也可增加宿主限制因子Smc5/6、STIM1、ZEB2和PSME4的泛素化水平，诱导其降解，从而增强cccDNA转录活性[25-26]。这些研究发现提示，靶向宿主因子和病毒蛋白HBx是失活cccDNA转录功能的重要策略，同时也为提高乙型肝炎功能性治愈率提供潜在的研究方向。

1.3 cccDNA的降解机制 除上述cccDNA合成与转录外，cccDNA降解是另一个影响CHB治愈的重要因素。HBV cccDNA半衰期是评估cccDNA降解的重要指标，但目前cccDNA的半衰期尚无定论。基于土拨鼠和鸭HBV感染模型的研究[27-28]提示，cccDNA的半衰期为33 d和57 d；尽管在灵长类动物黑猩猩上的研究[29]发现，急性感染时cccDNA半衰期约为3 d，但仍有少量cccDNA可持续数年。遗憾的是，目前尚无法获悉人感染肝细胞中单个cccDNA分子确切的生命周期。早期有数学模型推算在核苷和核苷酸类药物持续治疗下，机体完全清除肝内cccDNA至少需15年[30]；而Huang等[31]一项研究推测肝内cccDNA的半衰期在6个月左右。

解析cccDNA的降解机制，对于设计和评估抗病毒治疗策略十分重要。但目前对于cccDNA降解机制认识十分有限。2014年的一项研究[32]首次报道了胞苷脱氨酶APOBEC3A在促进cccDNA降解中的作用。2021年德国的研究者[33]进一步发现，干扰素刺激蛋白20与APOBEC3A协同作用，可有效降解HBV cccDNA。同时，本团队的研究[34]发现泛素结合酶UBE2L3通过泛素-蛋白酶体途径加速APOPEC3A的降解，从而有利于维持HBV cccDNA高稳定性。上述研究充分说明了胞苷脱氨酶APOBEC3A在cccDNA降解中的重要作用。但其他调控cccDNA降解的分子机制尚需探索，解析cccDNA降解机制仍是目前亟待解决的难点。

2 靶向cccDNA的药物研发进展

随着对cccDNA形成、转录和降解3个重要生物学过程调控机制的认识加深，以靶向清除cccDNA为目标的抗病毒治疗策略也日益增多。靶向HBV cccDNA的治疗策略被认为是最有可能清除HBV的手段。

2.1 抑制cccDNA形成药物研发进展 从理论上讲，抑制cccDNA形成的方式有两种，即阻断HBV感染和抑制rcDNA修复形成cccDNA。在病毒复制周期中，HBV通过表面preS1与肝细胞特异性受体NTCP结合进入肝细胞。基于此特性，MYR Pharma公司等研发了一种合成肽Myrcludex B，通过与HBV preS1竞争性结合NTCP，从而阻断HBV感染肝细胞[35]。此类通过靶向NTCP阻断HBV感染从而抑制cccDNA形成的药物还有hzVSF(Ⅱ期)、A2342(临床前)等。目前，Myrcludex B已经进Ⅱb期临床试验，其临床主要针对HBeAg阴性CHB患者，共纳入40例，每日使用1次Myrcludex B，皮下注射0.5、1、2、5、10 mg治疗12周(每种剂量8例受试者)。临床数据显示Myrcludex B耐受性良好，并观察到8例接受10 mg Myrcludex B治疗的患者中有6例(75%)在第12周出现HBV DNA下降>1 log10，40例患者中有22例(55%)ALT恢复正常。尽管Myrcludex B是一个很有希望的新型抗乙型肝炎药物，但仍存在几点问题有待进一步解决：(1)Myrcludex B只能抑制HBV再感染，而对已感染肝细胞中的cccDNA没有影响，肝人源化小鼠模型中显示一旦停用Myrcludex B，HBV复制出现反弹[36]。(2)研究[37]发现HepG2细胞模型中NTCP S267F突变会导致肝细胞对HBV易感性丧失，同时基因分析发现部分CHB患者为NTCP S267F变体纯合子[38-39]。以上数据提示NTCP可能不是HBV感染的唯一途径，针对NTCP的治疗策略可能无法完全阻断HBV感染。(3)NTCP的正常生理功能是运输胆汁酸，Myrcludex B并不能将病毒进入的抑制与胆汁酸转运的抑制完全分离，长期治疗可能会对患者产生不同程度的副作用。

值得一提的是李文辉教授团队研发出全人源性单克隆抗体HH-003。该药物直接靶向HBV表面大包膜蛋白的前S1(PreS1)区，阻断病毒与受体NTCP结合。一项基于64例慢性HBV感染者的 Ⅰ b期临床试验中，未观察到与药物相关的严重不良事件以及与药物相关的3级及以上不良事件。该药物目前已进入Ⅱ 期临床试验，HH-003抗病毒活性、安全性和药代动力学等，有待进一步评估。

而在抑制rcDNA修复形成cccDNA这一策略中，目前研究发现两种结构相关的二取代磺酰胺类(DSS)药物CCC-0975和CCC-0346能有效干扰rcDNA转化为cccDNA，从而阻断cccDNA形成[40]。但是该类药物抗病毒效能仅在培养细胞和原代鸭肝细胞中进行了验证。

2.2 失活cccDNA新药研发进展 RNAi是一种利用小分子双链RNA特异性降解细胞内同源mRNA，从而关闭靶基因表达的技术[41]，是目前全球用于开发乙型肝炎创新药物技术之一。siRNA通过和HBV RNA相互作用，从而促进HBV所有转录本的降解。现有多项采用RNAi技术的新药进入人体临床试验。ARO HBV(JNJ-3989)是由Arrowhead与Janssen Pharmaceuticals公司共同开发用于CHB治疗的RNAi疗法药物。该药物由两种靶向HBV RNA的siRNA组成并经N-乙酰半乳糖胺修饰，通过与脱唾液酸糖蛋白受体结合进入肝细胞，诱导HBV RNA降解，实现失活cccDNA的目标。目前JNJ-3989已经完成Ⅱa期临床试验，其纳入40例CHB患者。受试者在使用核苷类药物的基础上，需接受3次皮下注射JNJ-3989，注射剂量分别为100 mg(n=8)、200 mg(n=8)、300 mg(n=16)或400 mg(n=8)，每4周用药1次。研究结果显示，JNJ-3989联合核苷类药物治疗使39例患者实现了>1 log10IU/mL的HBsAg降低，且在392 d的试验过程中，未报告严重的不良事件或终止治疗事件。此外，目前在研的RNAi药物还有VIR-2218(Ⅱ期)、RG6346(Ⅱ期)、AB729(Ⅱ期)、RBD1016(Ⅰ期)和BB-103(临床前)等。但基于RNAi技术药物研发有以下几点值得注意。(1)靶向性：siRNA不具备对肝组织或细胞的靶向能力，且穿透细胞膜的能力极差。(2)稳定性：siRNA在人体循环系统中易被血液核酸酶降解，稳定性较差。(3)脱靶效应：siRNA可能依靠部分碱基与非靶基因结合，从而诱发与靶基因无关的脱靶效应。如果以上技术障碍取得突破，将推动RNAi药物更快地走向临床。

病毒蛋白HBx在启动和维持cccDNA转录过程中发挥关键作用。因此靶向HBx蛋白是实现cccDNA转录关闭的重要手段，而以HBx为靶点的药物研发近年也在不断进展。EYP001(Vonafexor)是ENYO Pharma公司研发的非胆汁酸第二代FXR激动剂，数据显示Vonafexor通过干扰核受体FXR与HBx的相互作用从而有效抑制HBV cccDNA转录。其Ⅱb期的临床结果显示，EYP001联合聚乙二醇干扰素治疗CHB患者16周后，HBsAg平均降低≥1 log10。本课题组也发现双香豆素可靶向HBx并促进其降解，进而显著抑制HBV cccDNA的转录，并在HBV感染细胞和小鼠模型中展现了较好的抗病毒效果，但目前尚缺乏临床研究数据[42]。

2.3 诱导cccDNA降解药物研发进展 除抑制cccDNA形成或失活cccDNA的药物研发外，通过细胞因子介导或基因编辑技术等诱导cccDNA降解也被认为是HBV新药发展的重要方向。研究[43]发现淋巴毒素-β受体(LTβR)激动剂可刺激肝细胞内APOBEC3B的表达，并通过诱导cccDNA脱氨基触发其非细胞溶解性降解，且在停止药物处理后仍具有抑制病毒的作用。但LTβR激动剂仅在HBV感染肝细胞和小鼠模型上进行了验证，其抗病毒作用仍然需要长期的临床试验去进一步证实。

基因编辑技术既可通过对cccDNA引入插入或缺失突变导致HBV病毒蛋白异常表达从而影响病毒复制，同时也可诱导部分cccDNA降解实现cccDNA的清除。基于序列特异性核酸酶的基因编辑方法已被研究应用于治疗病毒感染。PBGENE-HBV是Precision BioSciences开发的一种利用ARC核酸酶靶向HBV cccDNA的基因编辑药物，其通过脂质纳米颗粒传递至肝细胞并靶向cccDNA。临床前研究数据显示PBGENE-HBV可有效降解HBV感染的原代人肝细胞中的cccDNA，其有效率达75%，并伴随HBsAg水平的降低。小鼠实验也显示，单次给药后，PBGENE-HBV可对70%的HBV DNA靶标进行编辑。类似的基于基因编辑的药物还有EBT107、Undisclosed等，均处于临床前研究阶段。虽然基因编辑药物研发是一个高度活跃的研究领域，但也存在一些风险和限制，首先基因编辑系统对目标基因识别不是绝对特异性的，通过对基因编辑技术处理过的细胞进行基因组深度测序，可以明显观察到脱靶效应[44]；其次暂没有研究证明基因编辑技术可有效识别整合线性HBV DNA和游离的cccDNA，如果整合在染色体上的HBV DNA被切割，将极大可能导致宿主细胞染色体受损；此外，基因编辑治疗的选择压力会导致HBV产生耐药突变，因此应针对cccDNA设计多个编辑靶点，以尽量减少耐药变体的出现[45]。

3 小结与展望

寻找清除或失活cccDNA的最终方案，是一个系统问题，既涉及基础科学问题，也涉及临床问题。目前，HBV cccDNA研究仍面临许多挑战，包括：(1)HBV具有宿主特异性，目前仍缺少理想的研究cccDNA的细胞和动物模型。(2)cccDNA数量少，且易受rcDNA的干扰，目前尚缺乏标准的高敏感性cccDNA检测方法。(3)缺乏可直接表征cccDNA功能状态的新方法与新模型。(4)发展靶向失活或清除cccDNA的策略，有利于最终治愈HBV感染，但关于cccDNA活性调控和清除的机制目前尚未完全阐明。(5)临床上，迫切需要能够指示肝内cccDNA活性的新型血清标志物。(6)结合免疫治疗的多途径、多靶点药物联合阻断HBV的生物学合成并促进cccDNA清除将可能成为治愈CHB的重要途径。但是新型免疫治疗策略能否重建HBV特异性T淋巴细胞功能，并有效清除或失活cccDNA，也需要进一步明确。围绕以上诸多问题的多维度研究，将为寻找清除或失活HBV cccDNA的最终方案奠定基础。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：陈娟负责收集资料并撰写文章；黄爱龙负责文稿修订并最终定稿。