影响慢性乙型肝炎功能性治愈的因素及其机制

郭艺飞， 张继明,2

1 复旦大学附属华山医院 感染科， 上海市传染病与生物安全应急响应重点实验室， 国家传染病学中心，上海 200040； 2 上海市重大传染病和生物安全研究院， 上海 200032

慢性乙型肝炎(CHB)功能性治愈被定义为表面抗原(HBsAg)阴转伴或不伴表面抗体(抗-HBs)的出现，为CHB治疗的理想终点[1]。已有研究[2-3]显示HBsAg阴转与肝硬化甚至肝癌风险的降低密切相关。但是自发HBsAg的阴转发生概率极低，每年的HBsAg阴转率约为1%[4]。即使目前核苷(酸)类似物(NUC)与聚乙二醇干扰素α(PEG-IFNα)可以提高功能性治愈率，但由于两类治疗方法存在各自的局限性，因此了解影响CHB功能性治愈的影响因素及其机制对CHB治疗具有一定的指导意义。

1 影响功能性治愈的因素

1.1 HBV相关因素 HBsAg为实现功能性治愈的关键标志物。基线或停药时低HBsAg水平、治疗早期HBsAg水平的快速下降与较高的HBsAg阴转率密切相关[5-7]。除此之外，Pfefferkorn等[8]通过对83例经NUC或PEG-IFN治疗的CHB患者进行回顾性研究，发现作为HBsAg的组成成分之一的中表面蛋白，在总的HBsAg消失前(12.8±8.7)个月已检测不到，提示中表面蛋白定量检测可以预测HBsAg阴转。

HBeAg在HBV感染的慢性化中起着重要作用[9]，而且HBsAg阴转一般发生在HBeAg清除之后，提示HBeAg有可能影响HBsAg阴转[10]。一项关于富马酸替诺福韦酯治疗的研究[11]表明，在A或D基因型的人群中，HBeAg在治疗24周下降 ≥2.2 log PEIU/mL与更高的HBsAg阴转率相关。

血清中高抗-HBc水平可能与肝脏内炎症活动增强有关[12]。近期一项研究[13]发现，在接受干扰素治疗的CHB患者中，基线高抗-HBc水平(HBeAg阳性患者≥4.4 log IU/mL，HBeAg阴性患者≥4.0 log IU/mL)与更好的疗效和更高的HBsAg阴转率相关。

HBcrAg由乙型肝炎核心抗原(HBcAg)、HBeAg和p22cr三部分组成，可以反映肝内cccDNA水平与转录活性[14]。Sonneveld等[6]近期的停药研究发现HBsAg水平(<100 IU/mL)、低于检测下限的HBcrAg水平与更高的HBsAg阴转率相关。

关于自发阴转的一项大样本长期随访研究[15]表明，不论是基线还是随访过程中的HBV DNA水平均与HBsAg阴转有关。但是，在接受NUC和PEG-IFN治疗的患者中，HBV DNA与HBsAg阴转的相关性还需进一步研究。

HBV基因的分布在不同地区差异很大，欧洲主要以A、D基因型为主，东亚和东南亚地区主要以B、C基因型为主[16]。HBV感染的自然史研究及近期的停药研究[6,17]表明在亚洲人种中，C基因型患者发生HBsAg阴转的概率较B基因型患者高。在长期进行富马酸替诺福韦治疗的HBeAg阴性患者中HBsAg阴转多见于A和D基因型[18]。一项接受干扰素ɑ治疗的HBeAg阳性患者的长期随访研究[19]显示，47%的A基因型患者和44%的B基因型患者在随访78周过程中发生HBsAg阴转，只有28%的C基因型患者和25%的D基因型患者发生HBsAg清除。

1.2 宿主相关因素 研究[20]表明自发HBsAg清除与年龄有关，HBsAg阴转率随着年龄的增大逐渐升高。关于CHB儿童治疗的研究发现，越早治疗其HBsAg阴转率越高。一项关于1～17岁HBeAg阳性患儿长达13年的随访研究[21]显示，11.08%的患儿在PEG-IFN治疗72周后实现HBsAg阴转，在随访结束时，46.95%的患儿实现HBsAg阴转，其中1～7岁的患儿HBsAg的阴转率可达71.4%。近期关于学龄前儿童的研究[22]同样表明对于自发出现ALT水平升高且接受抗病毒治疗的患儿阴转率可达25%。

ALT水平升高被视为机体免疫介导清除病毒的表现，被证实与干扰素治疗实现的HBsAg阴转密切相关[5]。对于免疫控制期的患者，PEG-IFN治疗早期HBsAg水平的快速下降及12周时ALT的升高是预测HBsAg阴转的独立因素。

1.3 治疗方案 大量临床研究[23-24]证明NUC与PEG-IFN的联合治疗是实现HBsAg阴转最有效的方式。值得注意的是，相较于NUC与PEG-IFN的初始联合治疗，接受过长期NUC治疗并获得病毒学应答的患者加用或换用PEG-IFN治疗时HBsAg水平下降幅度更大且HBsAg阴转率更高[25]。

2 影响功能性治愈的相关机制

2.1 HBV相关因素影响功能性治愈的机制

目前关于HBV慢性感染的机制尚未完全阐明。观察性研究显示单独使用NUC并不能提高CHB的功能性治愈率，而以免疫调节为主要作用的干扰素却可显著提高HBsAg阴转率，提示功能性治愈的实现需要适度激活机体的抗病毒免疫。

2.1.1 HBV相关因素与特异性免疫 在HBV急性感染时，CD8+T淋巴细胞介导的细胞毒效应在HBV清除上发挥主要作用，但是在HBV慢性感染时，HBV特异性T淋巴细胞功能被抑制甚至出现耗竭[26-27]，还有研究[28]表明在HBsAg阴转的人群中呈现出与未阴转人群不同的CD4+T、CD8+T淋巴细胞表型，科学家推测恢复HBV特异性T淋巴细胞的功能可能是实现乙型肝炎功能性治愈的途径之一。Kim等[29]通过比较低HBsAg水平(<500 IU/mL)和高HBsAg水平(>50 000 IU/mL)患者中HBV特异性T淋巴细胞，发现HBV特异性CD4+T淋巴细胞上程序性死亡受体1(PD-1)在低HBsAg水平的患者中表达较低，使用PD-1阻断剂后可以提高T淋巴细胞的抗病毒免疫。但是也有研究[30-31]显示，HBsAg水平并不影响HBV特异性T淋巴细胞反应，患者年龄是影响HBV特异性CD4+、CD8+T淋巴细胞功能的关键因素。Aliabadi等[30]研究者发现低HBcrAg水平也与HBV特异性CD4+T淋巴细胞反应有关。此外，有研究[27]表明HBeAg状态也会影响HBV特异性T淋巴细胞，HBeAg阳性患者中针对核心抗原的干扰素γ和IL-10反应都受到抑制。近期一项研究[32]比较了急性HBV感染、慢性HBV感染以及功能性治愈人群中HBV特异性CD4+T淋巴细胞，发现在急性HBV感染的人群中呈现出强烈的HBV特异性记忆CD4+T淋巴细胞反应；慢性HBV感染者中，HBV特异性CD4+T淋巴细胞频率低且HBV特异性CD4+中央型记忆T淋巴细胞极少；功能性治愈者中，HBV特异性CD4+T淋巴细胞和CD4+中央型记忆T淋巴细胞的频率较慢性感染者明显增加，该研究提示HBV特异性CD4+T淋巴细胞反应在功能性治愈中发挥着重要作用。

B淋巴细胞介导的体液免疫应答在HBV清除中也起到重要作用，当应用B淋巴细胞清除疗法(如利妥昔单抗)时，HBV再激活风险显著增加[33]。在CHB患者中，HBsAg特异性B淋巴细胞在外周血中频率低，非典型性记忆B淋巴细胞(CD21-CD27-)的数量增加且分泌抗体能力较差[34-35]，使用PD-1阻断剂可部分恢复HBsAg特异性B淋巴细胞的功能[36]。相较于HBsAg特异性B淋巴细胞，HBcAg特异性B淋巴细胞频率高且分泌抗体能力较强，一项近期研究[13]发现基线抗-HBc水平与干扰素疗效密切相关，但造成HBsAg特异性B淋巴细胞与HBcAg特异性B淋巴细胞功能不同的机制尚未阐明。B淋巴细胞的主要作用是针对HBV抗原产生多克隆抗体从而发挥中和作用清除病毒，抗-HBs的出现被视为是CHB功能性治愈的标志之一，近期的一项研究[37]纳入感染HBV A基因型并接受NUC治疗HBeAg阳性的CHB患者，发现实现HBsAg阴转的患者中抗-HBs和HBsAg组成的免疫复合物的峰值与ALT峰值相重合，但是在未实现HBsAg阴转的人群中，两者的高峰并不重叠，提示抗-HBs在实现功能性治愈中扮演着重要作用。

2.1.2 HBV相关因素与固有免疫 HBV感染可逃避机体的固有免疫[38]。在一项探究HBV垂直感染更易慢性化的研究[9]中，发现亲代体内HBeAg可上调子代小鼠肝脏中巨噬细胞上细胞程序性死亡配体1(PD-L1)的表达，从而抑制HBV特异性T淋巴细胞，提示HBeAg在CHB的持续性感染中发挥着关键作用。本课题组通过比较CHB四个自然史时期的患者中髓系来源的抑制性细胞(MDSC)的频率，发现HBeAg阳性的CHB患者中MDSC频率明显高于HBeAg阴性患者，体外实验阐明了HBeAg可以诱导MDSC扩增，进而通过上调吲哚胺2,3-双加氧酶的表达抑制T淋巴细胞功能[39]。Visvanathan等[40]还发现HBeAg可下调肝细胞、Kupffer细胞和外周单个核细胞上Toll样受体(TLR)2的表达从而抑制TLR介导的抗病毒免疫。HBeAg除了可调节机体的免疫，Mitra等[41]研究人员发现胞内形式的HBeAg显著降低干扰素刺激反应元件的活性以及干扰素刺激基因(ISG)的表达，同时在干扰素治疗的患者中，HBeAg阳性的患者较HBeAg阴性的患者诱导ISG表达的能力弱。

树突状细胞(DC)在抗原呈递及活化T淋巴细胞过程中起到重要作用，当DC经HBsAg处理后，呈现出免疫耐受的表型，分泌IL-12即激活T淋巴细胞抗病毒的能力也大大减弱[42]，由此推测低HBsAg水平可以恢复DC的部分功能，活化T淋巴细胞的能力增强进而更易发生HBsAg阴转。NK细胞发挥抗病毒效应主要通过释放杀伤靶细胞的细胞因子(如干扰素γ、干扰素α等)和发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-medicated cytotoxicity，ADCC)[43]。在PEG-IFN治疗中，不论是肝脏内还是外周血中NK细胞功能增强组较未增强组其ALT水平更高且HBsAg水平下降更为明显[44]。此外，有研究[37]提示ADCC可能在CHB功能性治愈中也发挥一定的作用。

2.2 宿主相关因素影响功能性治愈的机制 在机体免疫系统尚未发育完全之前，HBV感染时年龄越小越倾向于形成HBV持续性感染，但临床研究[21]表明开始CHB治疗越早，功能性治愈率越高，其内在机制并未阐明。近期Fang等[45]研究者发现HBsAg可上调MDSC上的趋化因子受体CCR9，MDSC迁移至胸腺髓质区清除尚未发育成熟的HBsAg特异性T淋巴细胞，提示早期治疗有可能会逆转HBV的免疫耐受状态从而实现功能性治愈。除此以外，有研究[30-31]表明HBsAg水平并不影响HBV特异性T淋巴细胞反应，患者年龄是影响HBV特异性CD4+、CD8+T淋巴细胞功能的关键因素，当年龄<30岁时，HBsAg特异性T淋巴细胞占总HBV特异性T淋巴细胞群的28.26%，但当年龄>30岁时，此比例降至7.14%。

ALT升高主要是由免疫介导，可被视为体内清除病毒的表现，但由于影响ALT因素较多，探索ALT升高的相关机制对于确定CHB治疗方案非常必要。有研究[46]显示，在CHB患者中，HBV特异性CD4+T淋巴细胞以分泌TNFα为主，且该细胞频率与ALT水平相关，但这群细胞介导的免疫反应会加重肝损伤，而在实现功能性治愈的患者中，HBV特异性CD4+T淋巴细胞以分泌干扰素γ为主。该研究还发现在ALT升高期间，HBsAg下降水平与表面抗原特异性分泌干扰素γ的CD4+T淋巴细胞频率呈正相关。

2.3 治疗方案影响功能性治愈的机制 根据NUC与PEG-IFN联合治疗取得的良好成效提示参与抗病毒与免疫调节的相关机制在实现HBsAg阴转中发挥重要作用。PEG-IFN通过诱导ISG产生众多抗病毒蛋白,作用于病毒复制周期的各个阶段从而发挥直接抗病毒的作用，同时，体外实验[47]证实干扰素可促进胞内cccDNA降解。NUC直接靶向病毒的逆转录酶，有效抑制HBV的复制，此作用可增强PEG-IFN所激发的固有免疫与特异性免疫细胞功能，有助于HBsAg的清除[48]。

3 小结

目前针对HBV生命周期的抗病毒药物以及免疫调节类药物的研发为实现更高比例的功能性治愈带来了希望。但是关于CHB功能性治愈的机制仍未完全阐明，更为深刻的理解HBV免疫耐受形成机制以及如何消除免疫耐受将为之后实现CHB完全治愈提供可能。