外泌体程序性死亡受体配体1 在肿瘤免疫逃逸和治疗中的研究进展△

赵敏，吕冠平，王平义

1丽江文化旅游学院医学院，云南 丽江674199

2洱源县人民医院内四科，云南 大理671299

3西藏民族大学医学部，陕西 咸阳7120820

程序性死亡受体配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也 称PD-L1）也 被 称 为CD274 或B7-H1，是CD274基因编码的Ⅰ型跨膜蛋白，主要由免疫球蛋白V 样结构域和C 样结构域构成[1]。PD-L1 不仅广泛存在于身体各种细胞中，如肿瘤细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤（natural killer，NK）细胞、树突状细胞（dendritic cell，DC）和活化的T 细胞，还可以在身体某些不被免疫的部位（如大脑、角膜、视网膜）中存在[2]。在健康时，程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，也称PD-1）/PD-L1 信号通路的启动，与保持T 细胞免疫平衡、避免过度激活以及减少免疫环境损伤关系密切[3]。当发病时，PD-L1 与PD-1 相互作用，通过传递负调节信号来调控T 细胞介导的细胞免疫反应进程，该过程包含T 细胞的起始、生长、增殖、凋亡以及功能成熟[4]。Patsoukis 等[5]研究发现，PD-1/PD-L1 信号通路的启动能够将T 细胞周期停止在G1期，而不是直接导致细胞凋亡。并且PD-1/PD-L1 信号转导途径不仅可以介导T 细胞内在的抑制作用，还能够诱导调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）抑制T 细胞反应。外泌体作为细胞外小囊泡的主体组分，具有生物活性的脂质双层囊泡，从各种正常或肿瘤细胞中分泌而来，大小为30～120 nm。外泌体主要包含细胞质蛋白、微小RNA、环状RNA、长链非编码RNA、脂质、DNA、细胞因子、转录因子受体和其他分子。这些外泌体不仅在细胞凋亡和细胞间通信中起着关键的作用，还对细胞外环境和免疫系统的稳定起着重要的作用。研究证实，肿瘤或活化的T 细胞分泌的外泌体中富含免疫抑制蛋白，如PD-L1。PD-L1 及PD-1 是细胞凋亡的关键蛋白，也是肿瘤生长、转移的主要途径，主要通过负调节免疫反应促进肿瘤生长。具体表现为PD-L1 在肿瘤细胞表面高表达，并与活化T 细胞表面的PD-1 结合，可以引起T 细胞抑制，从而削弱了T 细胞的杀伤能力，进而使肿瘤细胞发生免疫逃逸。研究表明，PD-L1 可以通过不同的细胞信号通路来进行调控，或调节PD-L1 的表达水平，或直接影响PD-L1mRNA 的水平[6]，从而促进肿瘤生长和转移。说明PD-L1 的表达水平直接影响了机体的免疫功能，可以推测通过干预调控PDL1 表达的通路或基因，能够有效减少PD-L1 的表达，恢复机体免疫系统的防御功能。因此利用抗PD-L1 抗体与PD-1 的结合，或敲除PD-L1有助于抑制肿瘤的免疫逃逸，可能成为治疗恶性肿瘤的新途径。本文对PD-L1 在肿瘤免疫逃逸和治疗中的研究进展进行综述。

1 外泌体PD-L1 主要通过细胞信号通路促进肿瘤细胞免疫逃逸

1.1 PD-L1 通过磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）-雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）途径促进肿瘤细胞免疫逃逸

在肿瘤微环境中，致癌信号会通过PI3K-AKTMTOR 途径使PD-L1 增加。例如棘皮动物微管相关类蛋白4（echinoderm microtubule-related protein 4，EML4）-间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）和突变型表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）通 过 激 活PI3K-AKT 和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）-细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号通路增加非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中PD-L1 的表达[7]。Liu 等[8]在乳腺癌中发现PD-L1 与PD-1 相互作用后，可诱导AKT 和ERK磷酸化，从而激活PI3K/AKT 和促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/ERK 通路，促进乳腺癌细胞的扩散。另外，研究人员发现，源自内质网应激的肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞的外泌体能够提高PD-L1的表达及巨噬细胞中炎性细胞因子的含量，从而降低CD8+T 细胞比例，通过抑制磷酸酶张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）表达并随后激活AKT，增加T 细胞凋亡，抑制T 细胞功能，使肿瘤细胞发生逃逸[9]。研究发现，在肝癌组织中，hsa_circ0003288 的表达水平增加，并与PD-L1 的表达呈正相关。hsa-circ0003288 通过PI3K/AKT 通路和hsa-circ0003288/miRNA-145/PD-L1 轴促进上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和HCC 侵袭[10]。因此抑制hsa_circ0003288 的表达可能是治疗肝癌的一种潜在方法。Dong 等[11]在弥漫性大B 细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）恶性进展过程中发现，AKT/MTOR 信号通路被激活，PD-L1 表达增加，从而介导肿瘤细胞免疫逃逸。在鼻咽癌的研究中发现，PD-L1 过度表达后，激活下游PI3K/AKT 信号转导通路，导致鼻咽癌细胞恶性和侵袭性增加[12]。在胶质瘤中，PD-L1 在细胞饥饿时显著激活AKT/纤维状肌动蛋白（fibrous actin，F-actin）信号，同时抑制自噬信号，机制是PD-L1 通过AKT结合/激活被诱导的自噬细胞骨架崩溃，促进饥饿应激下胶质瘤细胞的侵袭[13]。研究发现，在肺癌中PD-L1 可上调细胞凋亡β蛋白，通过PI3K/AKT 信号通路抑制连环蛋白的降解。此外，还发现在肺癌细胞中，PD-L1 过度表达能使β-连环蛋白与伤口诱导蛋白（wound-induced protein，WIP）启动子结合后激活，促进肺癌发展[14]。

1.2 信号转导及转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）正向调控PD-L1 促进肿瘤细胞免疫逃逸

机体疾病状态下，STAT 发生磷酸化改变后，会形成二聚体，从而进入细胞与靶基因和细胞核结合，进而导致PD-L1 转录增强，促进肿瘤免疫逃逸。Jiang 等[15]研究发现，在耐鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）黑色素瘤细胞中，PD-L1 在STAT3 和c-Jun 信号通路共同调控下转录增强，且均为正向调控。另外，研究发现，核仁磷蛋白（nucleophosmin，NPM）/ALK 也可通过促进STAT3 与PD-L1基因的启动子结合，从而上调PD-L1 的表达[16]。研究CDC28 蛋白激酶调节亚基1B（CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B，CSK1B）在甲状腺乳头状癌（papillary carcinoma of the thyroid，PTC）中的作用时发现，CSK1B 的过表达可通过激活STAT3/PD-L1 信号通路和AKT 磷酸化促进PTC细胞的存活和侵袭[17]。在人肝癌细胞中，高尔基膜蛋 白1（Golgi membrane protein 1，GOLM1）通 过EGFR/STAT3 信号通路成为PD-L1 表达的阳性调节因子，其通过提高EGFR 水平促进STAT3 的磷酸化，上调PD-L1 的转录表达，进而促进肿瘤细胞转移和侵袭[18]。此外，在喉癌细胞中Yes 相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）/STAT3 活性失调可促进血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）分泌，通过激活血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）1-转化生长因子（transforming growth factor，TGF）增强M2 样肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）中PD-L1 的表达，从而形成免疫抑制[19]。膀胱癌中，肿瘤相关树突状细胞（tumor-associated dendritic cell，TADC）会产生高水平的CXC 趋化因子配体9（C-X-C chemokine ligand 9，CXCL9），显著增强膀胱癌T24 细胞中STAT3 的活化，进而增加T24 细胞中PD-L1 的表达[20]。

1.3 Janus 激酶（Janus kinase，JAK）-STAT 通路促进肿瘤中PD-L1 的表达

当STAT 被JAK 磷酸化后，形成二聚体，随后穿过核膜进入细胞核中，调节PD-L1mRNA 水平。在肿瘤环境中，γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）通过JAK-STAT 通路诱导PD-L1 的表达[21]。研究表明，在黑色素瘤、NSCLC、头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌和结直肠癌中，PD-L1 的表达与JAK-STAT 通路密不可分[22]。在黑色素瘤中，研究发现，STAT1/3/5被IFN-γ通过JAK1/2 磷酸化，同时抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶非受体2 型（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2，PTPN2）基因，从而增强JAKSTAT 信号和PD-L1 反应，进而使PD-L1 表达增加。Lin 等[23]和Wu 等[24]研究发现，胶质细胞源性神经营养因子（glial cell derived neurotrophic factor，GDNF）在头颈部鳞状细胞癌中，通过JAK2-STAT1信号通路诱导PD-L1 表达，从而促进肿瘤细胞免疫逃逸。研究发现，在NSCLC 中，因基因突变引起的JAK2 增减与PD-L1 表达水平升高降低显著相关，同时JAK3突变会导致PD-L1 表达增加[25]。研究发现，锌指蛋白多型2 反义RNA1（zinc finger protein multitype 2 antisense RNA 1，ZFPM2-AS1）负调控锌指蛋白多型2（zinc finger protein multitype 2，ZFPM2）的表达，并通过JAK-STAT 和AKT 途径，导致PD-L1 正向表达，进而促进NSCLC 细胞的增殖、迁移和侵袭[26]。此外，IFN-γ可通过STAT1 信号诱导A549细胞，显著抑制CD3+T细胞的增殖能力和上调PD-L1 的表达，从而促进肺癌的免疫逃逸[27]。在 卵 巢 癌 中，IFN-γ 诱 导 卵 巢 癌 细 胞Tyr-701 和Ser-727 中 的STAT1 表 达 和STAT1 磷 酸 化，并 且IFN-γ诱导的卵巢癌细胞PD-L1 表达受JAK/STAT信号调控，导致肿瘤生长和增殖[28]。Zhao 等[29]在结直肠癌中发现，IFN-γ诱导后，PD-L1 表达水平通过JAK2/STAT1 信号通路增加，从而加重结直肠癌扩散、侵袭。

1.4 核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）正向调控PD-L1 表达促进肿瘤逃逸

NF-κB作为一种蛋白质复合物和核转录因子，正向调控PD-L1表达，并与其表达水平显著相关[30]。在NSCLC 中，EGFR 通过NF-κB 调控PD-L1 的表达，从而促进肿瘤进展[31]。研究表明，在肿瘤微环境中，发现Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）刺激抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）后，通过NF-κB 通路上调PD-L1 表达，从而导致CD8+T细胞衰竭[32]。此外，Xu 等[33]在胃癌中发现EMT 通过激活NF-κB 信号通路，上调PD-L1 的表达，增强胃癌细胞的迁移和侵袭能力。研究表明，在结直肠癌中，脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1（apurinic-apyrimidinic endonuclease 1，APE1）与PD-L1 的表达呈正相关，且通过NF-κB 信号通路实现[34]。

1.5 缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）正向调控PD-L1 表达促进肿瘤逃逸

HIF-1α可以下调免疫细胞活性，正向调控PD-L1的表达，进而促进肿瘤细胞的免疫逃逸。研究人员发现，HIF-1α可以直接与PD-L1近端启动子的低氧反应元件结合，从而增强PD-L1 的表达，二者的表达呈正相关[35]。在胶质瘤中，PD-L1 在缺氧条件下被诱导表达，并且PD-L1 与HIF-1α呈正相关[36]。此外，在NSCLC 中PD-L1 和HIF-1α的表达密不可分[37]。研究发现，聚（L-天冬氨酸）-Poly（乙二醇）/梳蛋白酶A4[poly（L-aspartic acid）-Poly（ethylene glycol）/combretastatin A4，CA4-NPS]会 导 致HCC中HIF-1α高表达，同时诱导PD-L1 过表达，二者密切相关，促进肿瘤发展[38]。

2 PD-L1 在肿瘤治疗中的作用机制

虽然阻断PD-1/PD-L1 相互作用的单克隆抗体已在临床上用于肿瘤治疗，且效果显著，但仍有一些患者治疗反应不佳。究其原因，可能是外泌体PD-L1 治疗出现耐药性。

2.1 抑制PD-L1 对肿瘤的治疗作用

免疫检查点抑制疗法被广泛用于治疗各种肿瘤，其中通过阻断PD-1 及其主要配体PD-L1 结合，增强T 细胞对肿瘤细胞的杀伤力，是最成功的免疫治疗方法之一。以往研究发现，PD-1 广泛存在于肿瘤浸润淋巴细胞，同时PD-L1 在多种肿瘤细胞中上调，而利用单克隆抗体抑制PD-1或PD-L1可以显著提高肿瘤免疫。研究表明，针对PD-1/PD-L1的单克隆抗体在不同肿瘤患者中表现出显著疗效，如NSCLC、头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤、结直肠癌和乳腺癌[39-42]。利用肿瘤高度选择性的PD-L1 抗体对肿瘤进行治疗，发现肿瘤微环境中CD4+、CD8+T细胞浸润增加，成功增强了抗肿瘤免疫[43]。利用PD-L1 抗体对胰腺癌进行治疗发现，PD-L1 抗体通过调节PI3K/AKT/MTOR 信号通路，降低PD-L1 在肿瘤组织中的表达，达到治疗胰腺癌的目的[44]。而且抗PD-L1 抗体能够明显抑制小鼠肺癌CMT167和LLC 细胞皮下移植瘤的生长，同时促进移植瘤组织中CD8+T 细胞的浸润[45]。研究发现，人参皂苷Rh4 通过AKT/MTOR 途径抑制PD-L1 的表达，从而实现抗食管癌的作用[46]。同样，当抑制PD-1/PD-L1 表达时，可恢复CD8/Treg 比值和T 细胞抗肿瘤效应器功能，减轻砷促进的肺癌发生[47]。

研究发现，单纯的抗PD-L1 治疗虽然有一定效果，但是反应率较低，且耐药性较差。因此利用其他药物联合抗PD-L1 来治疗肿瘤是一种可以增加疗效且耐药性较好的选择。利用整合素αvβ3 的放射性核素靶向治疗联合PD-L1 治疗结肠癌，可以增强抗肿瘤疗效[48]。利用普伐他汀联合PD-L1 阻断剂治疗卵巢癌，结果发现患者血液样本中有细胞毒性T细胞活化的证据[49]。同样，在小鼠肿瘤模型中，带有177Lu 标记的高度肿瘤选择性的抗PD-L1 抗体的放射免疫治疗疗效明显优于单纯的抗PD-L1 治疗。它可以成功增强肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫，使肿瘤微环境中CD4+、CD8+T 细胞浸润增加[43]。CTX-8371（抗PD-1 和抗PD-L1 单克隆抗体结合在一个双特异性四价分子）在体外能有效增强T 细胞的活化和功能，对多种实体瘤模型、同种异体移植瘤和异种移植瘤具有单一治疗的疗效，疗效显著优于PD1/PD-L1 单克隆阻断剂[50]。原因可能是抗PD-L1 抗体可能一方面与PD-L1 直接结合，从而在肿瘤细胞表面保留很少的抗体来抑制PD-L1 的表达；另一方面可能是高浓度的PD-L1 可以与抗PDL1/PD-1 抗体竞争，从而削弱治疗肿瘤的目的。

2.2 敲除PD-L1 在肿瘤治疗中的作用

已有研究证实，当敲除外泌体PD-L1的时候，可以提高抗PD-L1 抗体在肿瘤中的治疗作用。在小鼠4T1 乳腺肿瘤模型中，通过敲除肿瘤细胞中的Rab27a 抑制外泌体分泌，敲除外泌体PD-L1，可显著提高抗PD-1 治疗的效率，抑制肿瘤生长[51]。在结直肠癌MC38 模型中，敲除外泌体PD-L1，可以显著抑制肿瘤生长和转移，通过PD-L1 阻断治疗延长生存期[52]。利用基因突变从TRAMP-C2 细胞中去除肿瘤外泌体PD-L1，可以有效增强PD-L1 阻断的效果，包括抑制肿瘤生长，提高脾脏细胞数量，以及激活淋巴结中的T 细胞反应[53]。在细胞毒性T淋巴细胞中，敲除PD-L1基因可以增强肿瘤细胞凋亡能力，可能是通过影响caspase 蛋白相关通路的作用而促进肿瘤凋亡[54]。因此敲除PD-L1可能是治疗肿瘤的另一种方法。

3 小结与展望

本文总结了外泌体PD-L1 主要通过PI3KAKT-MTOR 信号通路、STAT3 通路、JAK-STAT 通路、NF-κB 通路和HIF-1α通路正向调控，促进肿瘤的生长和转移，同时抑制T 细胞的活性，削弱T 细胞的杀伤力，促使肿瘤细胞逃避抗肿瘤免疫。同时，通过利用抗PD-L1 单抗和联合其他药物，以及敲除PD-L1来治疗肿瘤，都取得一定的疗效。值得注意的是，肿瘤患者血浆外泌体PD-L1 的表达与抗PD-1/PD-L1 治疗的应答率呈反比，且在动物模型中敲除外泌体PD-L1能够增强对抗PD-L1 阻断剂的反应。具体的结果还有待进一步的研究才能得出结论。目前外泌体治疗肿瘤的机制还不是很清楚，但是可以通过阻断信号通路来达到治疗肿瘤的目的。重要的是外泌体PD-L1 直接与抗PD-L1抗体相互结合而限制了治疗效果，而且，高表达的外泌体PD-L1 可以与抗PD-L1/PD-1 抗体竞争。因此联合其他药物与抗外泌体PD-L1 治疗肿瘤，可提高抗PD-1/PD-L1 阻断剂的疗效。因此关于外泌体PD-L1 在肿瘤中的作用，还应该更加深入地去研究，以期找到治疗肿瘤的新方法。