鼠类肉瘤病毒癌基因突变型晚期非小细胞肺癌的靶向治疗和免疫治疗进展

盛津津，马燕凌

1江汉大学医学院，武汉430056

2江汉大学附属湖北省第三人民医院肿瘤科，武汉4300330

肺癌仍是中国恶性肿瘤患者病死的主要原因[1]，其中最常见的病理类型是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。鼠类肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）突变是西方国家NSCLC 中最常见的突变类型，约占30%，在亚洲国家中约占10%[2]。近年来，精准靶向治疗明显改善了驱动基因阳性NSCLC 患者的预后，但KRAS突变型NSCLC 患者却未能从中获益，虽然免疫治疗的飞速发展为此类患者带来了生存获益，但疗效仍未有定论。目前，针对KRAS突变型NSCLC患者的治疗仍然以化疗为主，患者的预后较差，面对这一庞大的患者群体，临床迫切需要给予更多的关注与突破。可喜的是，部分研究在KRAS突变型NSCLC患者的靶向治疗领域取得了突破，且免疫治疗在这类患者的应用上也有了新发现。本文主要以KRAS 抑制剂为切入点，介绍靶向治疗和免疫治疗在KRAS突变型NSCLC 应用中的研究进展，希望对这一患者群体的个体化治疗有所帮助。

1 KRAS 信号通路

大鼠肉瘤癌基因（rat sarcoma oncogene，RAS）是一种原癌基因，包括Harvery 鼠肉瘤病毒癌基因（v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog，HRAS）、神经母细胞瘤癌基因（neuroblastoma ras viral oncogene homolog，NRAS）和KRAS，它们编码4 种高度同源的长度约21 000 Da 的三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）水解酶（guanosine triphosphatase，GTPase）。RAS 蛋白结构由二磷酸鸟苷（guanosine diphosphate，GDP）/GTP 结合域（G 域）和负责膜靶向的C 末端组成[3-4]。与GTP 结合时，RAS 具有生物活性，当GTP 水解为GDP 时，RAS 则失活。研究显示，多种信号通路相互协作可共同合成数种调节蛋白，而这些调节蛋白又调控着具有生物活性（与GTP 结合）及失活状态下（与GDP 结合）RAS蛋白的比例[5-7]。在生长因子的刺激下，RAS蛋白与鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide-exchange factor，GEF）相互作用，从而分离出与RAS结合的GDP，使GTP 与之结合，从而激活RAS 蛋白的活性[8]；当GTP 相对过剩时，RAS 蛋白会优先结合GTP 来发挥生物学活性[9]。此外，RAS GTPase 激活蛋白（GTPase activating protein，GAP）可通过促进与RAS相结合的GTP水解为GDP，使RAS蛋白失活[8]。

在正常细胞中，RAS 的活性状态受到复杂的机制调控，主要与一类鸟苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF）和GAP 的亚细胞移位相关，如受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）的激活会吸引RAS GEF 的募集，如SOS Ras/Rac 瓜氨酸核苷酸交换因子1（SOS Ras/Rac guanine nucleotide exchange factor 1，SOS1），从而激活细胞膜上的RAS 通路[10]。激活后的RAS 通路会通过促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）信号通路来促进细胞的生长和增殖[11-12]。正常情况下，RAS信号通路受到严格的调控，但当RAS 蛋白出现组成性激活突变时，细胞就会发生恶性转化[13]。大多数情况下，肿瘤细胞中RAS基因突变会使GAP 介导的GTP 水解过程出现障碍，使RAS 蛋白始终处于活性状态，从而促进肿瘤细胞的生长[14]。RAS 信号通路需要借助上游调控机制（RTK 通路）、下游调控机制[Src 同源区2 蛋白酪氨酸磷酸酶2（Src homology 2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase 2，SHP2）]和细胞外生长因子刺激才能发挥促进细胞生长和增殖的作用[15]。尽管目前的研究表明，上述过程涉及RAS、GEF、SOS1 的相互作用，但关于SHP2 是如何在这些条件下触发RAS突变的，尚未完全明确[16]。RAS基因突变存在多种亚型，其中KRAS突变发生率最高，约占人类肿瘤中RAS突变的83%[17]，而在所有KRAS突变中，G12 位点突变、G13 位点突变分别占81.5%、14.0%，其他位点突变相对罕见。12 位点和13 位点甘氨酸错义突变会使GAP 难以与GTP 结合，无法促进GTP 水解，使RAS 蛋白无法失活[18]。G12、G13 位点突变时，KRAS 失活受阻，可使与GTP 结合的具有生物活性的KRAS 蛋白得以累积[19]。

2 针对KRAS 突变的靶向治疗

约10%的亚洲NSCLC 患者存在KRAS突变。既往直接针对KRAS 蛋白的药物研发大多失败，主要原因包括以下两个方面：①KRAS 蛋白表面相对光滑，缺乏明确的疏水口袋，使化合物难以与之结合；②KRAS蛋白与GTP亲和力极高，因此难有化合物阻断KRAS 蛋白上的GTP 结合位点[20-22]。既往对KRAS突变NSCLC 的靶向治疗主要通过抑制其下游信号元件来间接阻断整个信号通路，如鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）突变抑制剂和丝裂原活化蛋白激酶的激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）突变抑制剂，但治疗有效率均不高。目前有研究在一些特殊位点的基础上发现了直接作用于KRAS 信号通路的化合物，研究已经进入临床试验阶段。

2.1 直接作用于KRAS G12C 的抑制剂

KRASG12C 指KRAS基因12 位点甘氨酸突变为半胱氨酸，约占KRAS突变肺腺癌的50%。半胱氨酸可与KRASG12 位点共价结合，使具有生物活性的KRASG12C 蛋白表面Ⅱ型开关下的特殊变构区域暴露出来[23]。新研发的药物则以此为靶点，诱导Ⅱ型开关功能紊乱，从而使具有生物活性的KRASG12C 蛋白上的GTP 水解为GDP，使多数KRASG12C 难以与GDP 结合而失去生物活性，从而影响其下游信号通路[24]。通过对上述化合物的拉网式搜索，终于找到一种可能用于临床的化合物——ARS-853，该化合物是一种针对KRASG12C突变的强效抑制剂，但未能成功验证其在体内的有效性。在ARS-853 的基础上进一步研发的RS-1620、AMG-510 和MRTX849 也均显示出了体内的生物活性，其中，AMG-510 和MRTX849 是RS-1620 的结构衍生物[24]。Klempner 和Hata[25]的Ⅰ/Ⅱ期临床试验均验证了AMG-510、MRTX849 的安全性及有效性，特别是针对NSCLC（该群体中KRASG12C 突变接近15%），50%具有KRASG12C 突变的NSCLC 患者可以从中获得临床获益。2019 年美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology，ASCO）公布的一项Ⅰ期临床试验共纳入32 例KRASG12C 突变型肿瘤患者（14 例NSCLC、19 例结直肠癌、2 例阑尾癌），给予AMG-510 口服治疗，在10 例可评估的NSCLC 患者中，0 例完全缓解、5 例部分缓解（partial response，PR）、4 例疾病稳定（stable disease，SD），疾病控制率达到了90%（9/10）；在18 例可评估的结直肠癌患者中，13 例SD，26 例患者仍在治疗中，9 例已停止治疗；患者对AMG-510 的总体耐受性良好，共报道了2 例3 级不良反应（贫血和腹泻），未出现4 级不良反应[26]。

2.2 KRAS G12C 抑制剂的耐药性

虽然关于KRASG12C 抑制剂的研究为NSCLC患者的治疗带来了希望，但需注意的是，KRASG12C 抑制剂仅对约50%的KRASG12C 突变型NSCLC 患者有效，还有部分患者初治疗效较好，但后续又出现肿瘤复发，也就是说，相当一部分患者对此类药物存在原发或继发性耐药。

部分研究发现，对KRAS 信号通路的低依赖性可能是原发性耐药的主要原因[27-28]。Singh 等[29]研究发现，KRAS突变肿瘤细胞的增殖可能不仅仅依赖于KRAS突变。Muzumdar 等[30]的研究使用RISPR-Cas9 技术完全敲除了KRAS基因，发现并未影响KRAS突变细胞的生长，这可能是因为存在替代的旁路信号通路，如AKT 信号通路或MAPK/PI3K信号通路。Misale 等[31]通过比较ARS-1620 与曲美替尼处理后的KRAS突变型NSCLC 细胞的存活能力发现，仍有一部分肿瘤细胞对这两种药物均耐药，这可能因为这类细胞主要是受ERK（KRAS 信号通路下游的主要效应器）的影响。尽管不同的细胞模型检测出的结论稍有不同，但一般来讲，肿瘤细胞增殖主要受MAPK/ERK 和PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白复合物1（mechanistic target of rapamycin kinase complex 1，MTORC1）信号通路的调控[32]，RAS 蛋白与PI3K p110 亚基的相互作用会引起AKT 的活化，但PI3K 的活化却不仅受RAS 的调控，在大多数KRASG12C 的细胞模型中，AKT 和MTORC1 效应蛋白S6 的磷酸化状态几乎不受KRASG12C 抑制剂的影响[33-34]，相反，KRASG12C抑制剂主要通过MAPK/ERK 通路来发挥作用。因此，KRASG12C 抑制剂原发性耐药的主要原因是肿瘤细胞冗长且并行的信号通路，绕开了KRAS 信号通路来促进肿瘤细胞的生长增殖。此外，还有部分原因是肿瘤细胞同时存在其他基因突变，以及肿瘤细胞存在异质性，这使不同个体对药物反应会有所不同，甚至是同一个体不同部位的肿瘤对药物的反应也不尽相同[35]。

关于继发性耐药的机制，Xue 等[36]探讨KRASG12C 快速耐药的机制，以及KRASG12C 突变细胞亚群对这类药物耐药方式的差异性，结果发现，给予同源肺癌细胞群RS-1620 处理后，细胞群出现凋亡、静止和快速恢复增殖3 种状态，通过分析快速恢复增殖的细胞亚群发现，这类细胞通过合成新的KRASG12C 抵抗药物的作用，而新的KRASG12C 又通过增强对EGFR 和SHP2 信号通路的依赖来维持其活性及对RS-1620 的抵抗状态。此外，通过KRAS 及其下游原件c-RAF 蛋白与人源极光激酶A（aurora kinase A，AURKA）的相互作用，肿瘤细胞躲过药物的抑制作用。Ryan 等[37]的研究发现，经RS-1620、AMG-510 治疗后，肿瘤细胞被再次快速激活，重新开始增殖的原因是野生型RAS信号通路（包括NRAS 和HRAS）活性增加，激活其下游原件，而KRAS 则保持着抑制状态。以上两大研究虽然表现出野生型RAS信号通路对于继发性耐药的意义不同，但两者均发现了RTK-SHP2 激活增加是整个RAS 信号通路重新激活的原因，这也是克服继发耐药必须要解决的问题。

3 KRAS 突变的NSCLC 的免疫微环境及免疫治疗

KRAS突变不仅与肿瘤细胞的恶性增殖与侵袭相关，还会影响肿瘤免疫微环境（tumor microenvironment，TME），进而影响免疫治疗疗效[38]。Coelho等[39]的研究显示，人类肺癌中，RAS 信号通路的激活与程序性死亡受体配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）表达上调有关，PD-L1 表达上调会增强肿瘤细胞的免疫逃逸，这意味着RAS 信号通路的激活可以直接帮助肿瘤细胞进行免疫逃逸。RAS信号通路可以通过调节AU富集区与锌指蛋白（tristetraprolin，TTP）的结合，来提高PD-L1mRNA 的稳定性，从而上调肿瘤细胞PDL1 蛋白的表达，而TTP 通过PD-L1mRNA 的3'-非翻译区（3'-untranslational region，3'-UTR）的AU 富集区来对PD-L1 蛋白的表达进行负反馈调节。RAS信号通路的下游MEK可通过MK2蛋白激酶来使TTP 磷酸化而抑制其功能。在体内，TTP 表达的恢复可以通过降解PD-L1mRNA、下调肿瘤细胞PD-L1 的表达来增强抗肿瘤免疫反应，这为KRAS突变NSCLC 的免疫治疗提供理论基础。Dong 等[40]的研究证实了肺腺癌细胞KRAS突变可以显著上调PD-L1的表达，特别是KRAS和TP53双突变的患者，可以更好地从PD-1 抑制剂中获益。Li 等[41]的研究也表明，KRAS突变NSCLC 患者的PD-L1 阳性表达率高于KRAS野生型患者（51%vs36%，OR=1.69，95%CI：1.01～2.84，P=0.045）。

di Magliano和Logsdon[42]通过构建KRAS突变的胰腺癌小鼠模型发现，KRAS突变的肿瘤细胞会分泌炎性介质，影响肿瘤细胞周围的基质细胞、成纤维细胞及免疫细胞，从而影响TME。Ji等[43]构建了KRASG12D位点突变的肺腺癌小鼠模型，结果发现，KRAS信号通路的激活导致了以不典型增生-腺瘤-腺癌为特点的渐进式恶性改变，且在此细胞系中可以检测到大量炎症趋化因子，如巨噬细胞炎性蛋白-2（macrophage inflammatory protein-2，MIP-2）、LIX、KC等，表明KRAS活化与炎症环境相关。多项研究探讨，肿瘤炎性环境与肿瘤发生发展的关系及一些细胞因子[如白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-17C、IL-22、IL-8]和KRAS突变的肺癌之间的联系，慢性炎性环境可能会导致KRAS基因突变和肿瘤的发生发展，KRAS突变又会加重炎性环境，抵抗化疗及免疫治疗[44-46]。上述研究不仅探讨了KRAS突变NSCLC 的免疫微环境，还为此类患者的治疗提供了新方向，是否能够通过干扰这些细胞因子来改变KRAS突变的NSCLC免疫环境，以改变KRAS突变肿瘤细胞的天然免疫逃逸，增强免疫治疗或其他治疗的疗效，甚至是通过干扰细胞因子的表达来干扰肿瘤的进程，这类问题还需要更多的临床研究进行验证。

既往有关KRAS突变患者免疫治疗疗效的研究较少，且结论不尽相同。Lee 等[47]综合多项随机临床试验数据分析后显示，与KRAS野生型NSCLC患者相比，使用免疫检查点抑制剂患者的中位无进展生存期（progression-free survival，PFS）为2.1个月（95%CI：1.8～3.1 个月），中位总生存期（overall survival，OS）为13.4 个月（95%CI：10.2～17.0 个月），而化疗患者的中位PFS 为3.9 个月（95%CI：3.1～4.8个月），中位OS 为8.6 个月（95%CI：6.2～13.4 个月），表明免疫检查点抑制剂可以显著延长KRAS突变NSCLC 患者的OS（HR=0.65，95%CI：0.44～0.97，P=0.03）。Kim 等[48]纳 入509 例NSCLC 患 者（其 中KRAS突变型138 例，KRAS野生型371 例），随机分为免疫治疗组（接受纳武单抗或阿特珠单抗治疗）和化疗组（接受多西他赛治疗），结果显示，与KRAS野生型NSCLC 患者相比，KRAS突变患者可从免疫治疗中获益，且KRAS基因突变可作为预测免疫治疗疗效的潜在生物标志物。但另外两项研究发现，免疫检查点抑制剂的疗效与KRAS突变状态无关[49-50]。这可能与KRAS 冗长且复杂的信号通路相关，后续可考虑将KRAS突变型肿瘤患者进一步分层来分析其中的关联。

4 小结与展望

目前，针对KRAS突变型NSCLC 的靶向治疗已经取得了很大的突破，过去关于这类患者的靶向治疗疗效欠佳，且预后较差，但直接针对KRASG12C 位点药物的出现打破了这一僵局，未来关于这类患者的精准靶向治疗有望打开新篇章。免疫治疗的快速发展也给这类患者带来不一样的希望。KRAS突变型NSCLC 的特殊免疫微环境或可更好地从免疫治疗中获益，且KRAS可能成为免疫治疗疗效预测的生物标志物，虽然对这类研究尚存在争议，但未来可能可以通过对KRAS分层来进一步分析取得突破。即使各项研究不断突破，但抗肿瘤治疗的手段依旧有限，且存在耐药及不良反应不能耐受等问题，因此，抗肿瘤治疗应促使所有的治疗手段发挥其最大作用，且权衡出最适宜的个体化联合方案，才能为患者带来最大的临床获益。期待未来对于KRAS突变患者的靶向治疗、免疫治疗、靶向治疗+免疫治疗+化疗等联合治疗手段的更多研究发现。