BMI1作为头颈鳞癌干细胞标志物的研究进展*

黄炀，马洪，李超，周可

550004 贵阳，贵州医科大学附属口腔医院 口腔颌面外科(黄炀、马洪、周可)；610041 成都，四川省肿瘤医院·研究所，四川省癌症防治中心，电子科技大学医学院 头颈肿瘤外科(李超)

头颈癌是全球第六大最常见的恶性肿瘤，每年约有63万例新确诊病例，超过35万人死亡，患者5年生存率约为50%[1-2]。头颈癌中最常见的癌症类型为头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)，其起源于口腔、鼻腔及咽喉等部位。其中包括口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC) 及喉癌(laryngeal cancer，LC)等[3]。癌症干细胞(cancer stem cells，CSCs)是肿瘤内具有干细胞特性的独特群体，存在于多种癌症中，在HNSCC中已发现该干细胞亚群,其具有较高的自我更新能力、分化能力、致瘤能力和放化疗抗性[4-5]。头颈鳞癌干细胞亚群仅是小部分头颈鳞癌细胞，但它们在肿瘤向人体其他器官的转移中起着关键作用。近年来研究发现B细胞特异莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1(B cell-specific moloney murine leukemia virus insertion site 1，BMI1) 的表达与这些表型相关，在原发肿瘤中BMI1阳性表达的CSCs自我更新和分化能力增强，并可介导头颈鳞癌 CSCs的侵袭性生长和颈淋巴结转移[5]。目前，HNSCC主要应用多学科综合序列治疗，包含手术切除、化疗和放疗的联合治疗方法。由于CSCs耐药性及辐射耐受的特性，伴随而来的是疾病的不良预后。明确BMI1作为肿瘤干细胞生物标志物并使之成为治疗靶点，对于优化HNSCC的治疗策略具有重要意义。本文将对近年来有关BMI1作为生物标志物对头颈鳞癌CSCs的影响的相关文献进行复习，并基于国内外最新共识对此作一综述。

1 BMI1的结构与功能

PcG蛋白-多梳家族蛋白是一类在染色质水平抑制靶基因转录的蛋白，包含了多梳抑制复合体(polycomb repressive complex,PRC)1和PRC2两个核心蛋白复合体，在胚胎发育、细胞记忆、细胞周期、细胞增殖和肿瘤形成等过程中起关键作用[6]。作为PRC1中的核心成分，BMI1是一种表观遗传调控因子，可通过介导转录沉默和组蛋白H2AK119Ub的沉积，促进DNA末端切除，从而影响DNA双链断裂的同源重组修复进程[7]。BMI1还可通过组蛋白的甲基化修饰过程来控制组织干细胞的细胞周期和自我更新[8]。人类BMI1基因位于10号染色体短臂1区3带(10p13)，长约10 kb，由10个外显子和9个内含子组成。该基因编码3.4 kb的cDNA以及36 KDa的蛋白质，由326个氨基酸组成[8-9]。BMI1蛋白由三个重要区域构成,包括：1)中心部分的螺旋—转角—螺旋—转角结构域，此为DNA结合结构域，是影响BMI1转录活性的重要核心区域；2)氨基末端保守的指环区域，可促进DNA同源重组修复,与细胞增殖和抑制蛋白表达有关；3)羧基端的PEST样区域，富含脯氨酸及丝氨酸残基，与促进细胞内BMI1快速降解相关[7,10-11]。以上特征决定了BMI1作为肿瘤干细胞潜在生物标志物发挥功能的基础。

2 头颈鳞癌干细胞与BMI1

BMI1作为一种关键的头颈部肿瘤干细胞调节因子，通过H3-K27蛋白的三甲基化和H2A-K119蛋白的泛素化，与c-Myc蛋白协同抑制Ink4a/Arf位点，负调控下游效应分子p16INK4a、p19Arf和p53等，控制细胞周期阻滞和细胞凋亡[6-7,12]。大量的转录和转录后调节因子也参与调节BMI1的表达，其中包括N-Myc、八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4，OCT4)、Sp1、碱性螺旋-环-螺旋转录因子1(Twist1)、叉头蛋白M1、E2家族转录因子1和婆罗双树样基因4[9,13-14]。研究表明，癌细胞可通过OCT4诱导分化抑制因子1(inhibitor of DNA binding 1，ID1)和NF-κB协同触发BMI1和CD44 mRNA高表达，促进头颈部CSCs的生成[15]。跨膜蛋白CD44作为头颈部肿瘤干细胞特性最敏感的生物标志物之一，对于维持肿瘤异质性必不可少[16-17]。Prince等[17]经免疫组织化学分析，发现CD44+HNSCC的CSCs中表达高水平的核BMI1，并呈膜高表达CD44与核高表达BMI1基因的特点分布排列在肿瘤微域中。同时证明了HNSCC的CSCs亚群在小鼠体内有强致瘤性且表现出异质性表达。有证据显示，在HNSCC中BMI1+CSCs可选择性地获得共刺激分子CD80的高表达以抑制CD8+T淋巴细胞的活性，从而逃避免疫及化疗药物的杀伤，而当抑制BMI1后观察到DNA损伤的特异性标志物pH2A.X在HNSCC中显著升高，同时诱导了与CD8+T细胞募集相关的趋化因子(MIG、IP-10、I-TAC 和CCL5)的转录，促使其向肿瘤病灶区域的募集，杀伤肿瘤细胞[4-5,18]。乳腺癌相关研究表明BMI1、Wnt/β-catenin、Notch、PI3K-AKT-mTOR、和Hedgehog(Hh)等信号通路控制着乳腺癌干细胞在主要区域上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的激活以及肿瘤的发生与生长[19-20]。在NPC细胞中BMI1过表达可诱导EMT，激活NPC上皮细胞株与喉声门下细胞(human subglottic,HSG)的端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,HTERT ) ，促进口腔上皮的异常增生[12,21-23]。而当敲除BMI1或使用BMI1抑制剂时，可逆转肿瘤细胞以上生物学进程。随着研究的深入，越来越多证据指向BMI1对头颈鳞癌CSCs的发生发展关系密切，在头颈鳞癌的疾病进程起着重要作用。

2.1 OSCC与BMI1

OSCC是多发于舌、颊、牙龈及唇等部位的口腔恶性肿瘤[1]，该病的主要危险因素与吸烟、饮酒和咀嚼槟郎等行为，以及由人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)16和HPV18和EB病毒引起的感染密切相关[24]。OSCC中CSCs亚群的存在是其复发及不良预后的重要原因，也是其肿瘤异质性的决定因素，调控正常干细胞分裂的信号通路(BMI1、Notch、Wnt和Hedgehog等)也参与了口腔癌的发生，细胞信号通路发生异常激活后，通路之间的串扰促使CSCs的生长，并调节OSCC细胞的活性[25]。Kalish等[26]通过4-硝基喹啉1-氧化物(4-nitro-quinoline 1-oxide,4-NQO)诱导舌上皮干细胞BMI1异位过表达小鼠口腔癌变模型，发现外源性BMI1的表达改变了正常舌上皮中蛋白质翻译和氧化还原的稳态，增加了小鼠对OSCC的易感性，加强了BMI1作为人类OSCC治疗靶点的证据。Rao等[27]研究发现OSCC样本中BMI1、OCT4和乙醛脱氢酶1(aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)三种细胞表面标记物均阳性表达的病例生存率较单一BMI1表达病例生存率显著降低，三者可作为一组有效标志物预测患者的预后，提高OSCC的CSCs亚群识别准确度。有趣的是，BMI1过表达还与口腔癌变过程中的上皮异常增生有关，是口腔黏膜下纤维化[28]、口腔白斑[29]、口腔红斑[23]、口腔扁平苔藓[30]患者向OSCC发展的预测指标之一。

2.2 NPC与BMI1

NPC是发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，在东南亚地区及我国华南地区高发[31]。其发病解剖位置隐蔽，早期症状与良性病变相似，早期确诊患者比例不足20%[32]。鼻咽周围毗邻脑干等重要器官，且对放射治疗高度敏感，因此放疗是无远处转移NPC患者的重要治疗手段[31,33]。NPC患者在接受放疗后，由于辐射损伤导致口腔上皮细胞DNA双链断裂，BMI1被募集到DNA损伤位点以促进辐射损伤后的修复。然而BMI1的持续过表达，伴随其下游靶基因p16、p14的下调，促进了第二原发口腔鳞癌的发生及进展[34]。Deng等[35]研究发现干细胞标志物CD44高表达的NPC干细胞样细胞(cancer stem cell-like cells,CSC-LCs) 在抑制BMI1后可显著提高其放疗敏感性，促进CSC-LCs的细胞杀伤作用。经BMI1 shRNA慢病毒载体特异性下调BMI1后细胞周期进程受抑制，然而DNA DSB修复具有强细胞周期依赖性。sh-BMI1 CD44+NPC-CSC-LCs接受放射刺激后 G1期延长,对辐射最敏感的G2/M期阻滞，导致DNA DSB修复率显著降低,细胞凋亡增加。Xu等[36]通过裸鼠体内成瘤实验证实了sh-BMI1可削弱CD44+NPC-CSC-LCS的体内致瘤性。BMI1也参与EMT过程，调控癌细胞的迁移与侵袭能力。E-钙粘蛋白(E-cadherin)和Twist1作为EMT的标志物，一方面Twist1可直接增强BMI1的转录。另一方面，在锌指转录因子的介导下，BMI1能与E-cadherin启动子结合，抑制E-cadherin的表达同时上调纤维连接蛋白及波形蛋白,进而导致鼻咽上皮细胞迁移及侵袭力增强[12]。此外，BMI1还可与抑癌基因PTEN位点结合，下调PTEN的表达后激活PI3K-Akt通路，促使NPC复发[37]。由此可推测BMI1是激活PI3K-Akt通路、诱导EMT、促进肿瘤发生发展的重要影响因子。

2.3 LC与BMI1

LC的发病率占头颈部恶性肿瘤的13.9%，以鳞状细胞癌最常见[38]。Fernandes等[39]使用干细胞表面标记物CD44、CD133和CD117，将LC细胞区分为喉癌干细胞(laryngeal cancer stem cells,LCSCs)和喉癌非干细胞(non-LCSCs),证实了LC细胞株Hep-2的LCSCs亚群具有更强的致瘤潜能。LC常伴有低氧应激，在低氧条件下，LC细胞株Hep-2和AMC-HN-8显示出G0/G1期的扩增细胞，并表现出缺氧诱导因子的上调，以及干细胞基因OCT4、SOX2和NANOG表达增加和CD133的优先表达[40]。CD133是广泛认可的LCSCs标志物之一，Wei等[41]利用壳聚糖-甲氧基聚乙烯纳米粒合成了沉默BMI1基因的CD133+Hep-2肿瘤细胞(mPEG-CS-BMI1RNAi-NPs)，将其与紫杉醇共培养时，CD133+BMI1RNAi细胞对化疗的敏感性较CD133+Hep-2肿瘤细胞增强，侵袭能力降低，证明BMI1的表达是CD133+LCSCs致瘤性的核心。研究显示BMI1过表达可显著抑制喉癌细胞系Hep-2的放化疗敏感性，促进喉鳞状细胞癌的进展[42]。有趣的是，单独BMI1基因的过表达并不能促使细胞癌变。Tan等[22]研究报道，单独转染BMI1的原代喉上皮细胞在裸鼠体内不具有活体成瘤的特征。另一项实验证明，未经致癌物4-NQO诱导的BMI1异位过表达转基因鼠不发生癌变[26]。证明了BMI1需要与其他影响因子互相作用，发挥致癌性。大多数癌症通过DNA的逆转录合成来激活端粒酶并延长端粒，以避免细胞死亡和获得无限增殖能力。而BMI1可通过特异性激活上皮来源细胞的端粒酶，诱导喉上皮细胞永生化。Tan等[22]研究人员将BMI1基因转导入HSG，发现细胞中HTERT和磷酸化Rb的表达明显增强并保持稳定，HTERT表达上调是细胞无限复制的最常见途径，由此克服稳定传代的寿命限制，衰老细胞减少，细胞增殖能力显著上升。

3 BMI1与头颈鳞癌的治疗

3.1 BMI1靶向治疗

到目前为止，化疗、放疗和手术治疗仍然是HNSCC的常规治疗方法，由于CSCs存在化疗耐药和放射治疗耐受性，使其能够逃脱放化疗的杀伤。已知头颈癌干细胞对5-氟尿嘧啶、顺铂、多西紫杉醇、西妥昔单抗和PI3K抑制剂(ZSTK474和PX-866)有耐药性[39]。目前，抗程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)的免疫检查点抑制剂和化疗药物的联合疗法已被批准用于复发性或转移性头颈癌的一线治疗，对HNSCC的治疗效果有所改善。但患者对该联合疗法的客观应答率不高，中位应答持续时间相对较短[4]。此外，Jia等[4]发现，在HNSCC中联合应用抗PD-1单抗和顺铂可以促使非干细胞肿瘤细胞的凋亡，却不能有效针对可逃避CD8+T细胞杀伤作用的BMI1+CSCs，反而造成了病灶处BMI1+CSCs的富集，最后导致肿瘤复发机率上升。最近的一项研究表明，BMI1参与了RAD51依赖的复制应激反应(replication stress,RS)，当使用BMI1抑制剂时，乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,bCSCs)内RS大量增加，这导致了bCSCs的化疗敏感性上升，最终bCSCs比例降低[43]。因此，靶向破坏CSCs将成为治疗的新方向。BMI1作为与CSCs密切相关的调节因子，靶向BMI1小分子是控制癌症进展的有效途径。2014年，Kreso研究团队首次发现BMI1特异性抑制剂PTC-209可在肿瘤组织内负调控BMI1、抑制结肠及直肠癌细胞的生长，可对大肠癌起始细胞造成长期且不可逆转的损害[44]。PTC209现已逐渐应用于胆道癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、慢性粒细胞白血病和多发性骨髓瘤等癌症治疗的研究中[43,45]。在HNSCC中使用PTC209或敲除BMI1基因后，联合抗PD-1单抗或顺铂治疗可募集和激活CD8+T细胞，诱导肿瘤细胞的内源性免疫反应，增强药物对CSCs的杀伤作用。经观察发现，使用该联合治疗方案的HNSCC细胞中BMI1+肿瘤细胞稀少存在或未能检测到，细胞侵袭性降低，病灶面积更小甚至无法检测到病灶，复发率更低[4,46]。由此，笔者认为靶向BMI1+CSCs将成为癌症临床治疗的重要探索方向。2018年，Dey等[47]首次报道了第二代BMI1特异性抑制剂PTC-028，其通过诱导BMI1过度磷酸化而逐渐耗竭，激活Caspase依赖的细胞凋亡，显著影响卵巢癌细胞的克隆生长与活力。在卵巢原位癌小鼠模型中，口服PTC-028具有单药抗肿瘤活性，与顺铂或紫杉醇腹腔注射疗效相似。而PTC-596作为另一种常用小分子BMI1抑制剂，可特异性诱导BMI1蛋白在纳米分子水平上降解，导致急性髓细胞性白血病细胞系和原代母细胞的线粒体凋亡且对正常造血细胞无影响。目前已进入晚期实体肿瘤患者的第一阶段临床试验(NCT02404480)[45]。

3.2 放射治疗

放化疗常作为晚期及复发性恶性肿瘤的重要治疗手段，但电离辐射会引起口腔黏膜炎、口干、放射性骨坏死和第二原发肿瘤等一系列并发症[34]。有研究报道，头颈部CSCs细胞在接受2.5 Gy至高达10 Gy剂量的电离辐射处理后，评估CSCs的球体迁移及存活率，结果显示球体迁移区域没有显著变化，且细胞活性测定观察到CSCs的高存活率，证实其极强的抗辐射能力[48]。Hu等[34]采用体外培养的正常人角质形成细胞系HaCaT进行放疗，经照射后的HaCaT细胞中BMI1表达显著上调，且与X射线照射时间成正比。多项研究报道称，当敲除BMI1基因或靶向BMI1高表达的 CSCs时，头颈癌[27]、乳腺癌[9]、直肠癌[49]、肝癌[50]等CSCs的放射敏感性显著增加。因此，减少辐射抵抗的影响因子、增强肿瘤放疗敏感性对于提高头颈癌临床疗效至关重要。由此可认为，BMI1是治疗头颈癌等实体瘤的可行靶点，具有较大的研究意义。

4 总 结

迄今为止，各研究报告显示BMI1的异常表达可对CSCs的增殖、分化、肿瘤形成和对放化疗的耐受性产生影响，导致患者治疗效果不佳，其作为HNSCC CSCs标志物的证据丰富。相比于使用单个基因作为生物标志物，将BMI1结合CD44、CD133、ALDH1及OCT4等共表达组合可提高肿瘤干细胞识别精度[27]。笔者认为，未来仍需深入研究BMI1在p16、p53、Twist1、Snail、PTEN、RAD51及Rb等上下游调控因子中的作用及引发的后续效应，进一步探讨BMI1与PTEN、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)相互作用后激活的PI3K-Akt通路，以及BMI1诱导端粒酶活性和驱动EMT等过程对HNSCC病程发展的影响。此外，合理应用BMI1的靶向药物，可协同现有的肿瘤治疗策略，优化HNSCC治疗方案，提高BMI1+CSCs细胞的杀伤率，降低疾病复发率。对于不同头颈区域的鳞癌，其生理解剖特点及癌症生物学特性存在差异，后续研究仍需关注BMI1对于各部位头颈肿瘤干细胞的异质性，以探索头颈部鳞癌的差异化、精准化治疗。

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