生物标志物与小儿烧伤脓毒症的早期诊断*

朱悦悦，朱振洪

（苏州大学附属儿童医院小儿烧伤整形外科，苏州 215000）

脓毒症被认为是由宿主对感染的反应失调导致的危及生命的器官功能障碍[1]。烧伤创面的持续开放，肠道屏障功能失调，重度烧伤患者所需的侵入性设备如中央静脉和动脉导管，严重烧伤患者多处于代谢亢进及免疫抑制状态等，这些都增加了烧伤患者潜在的感染和烧伤脓毒症风险，小儿烧伤患者则因为代谢调节能力和免疫功能不成熟，更易受到烧伤脓毒症的威胁[2]。随着烧伤护理措施的改善，液体复苏和营养支持水平的提高，烧伤患者的死亡原因已经从休克转变为脓毒症及其并发症占主导地位[3]，烧伤脓毒症的早期识别和积极干预显得极为重要。

然而，长期暴露于炎症介质及亢进的代谢水平使许多脓毒症诊断指标如发热、心动过速、呼吸急促、白细胞增多等全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）症状成为烧伤群体的常见临床表现，加之不同年龄段儿童生理特征的特殊性，这些传统指标对小儿烧伤脓毒症患者的早期诊断和严重性评估价值不高。采样时间、方式、培养效率等使微生物培养在烧伤脓毒症早期诊断的应用也存在一定的局限性[4]。因此，脓毒症标志物对于烧伤脓毒症的早期诊断一直是国内外研究的热点。尽管小儿烧伤好发，但由于多为小面积烧伤，相关脓毒症标志物对小儿烧伤患者的诊断和临床应用却较为局限。

1 传统脓毒症标志物与小儿烧伤脓毒症的早期诊断

1.1 C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）CRP 是由肝脏合成的急性时相蛋白，能结合病原体和受损细胞的磷脂成分，激活受体并活化补体系统发挥作用，是反映机体损伤和感染的敏感指标之一。烧伤后24 h内患者血浆CRP 水平明显升高，48 h 达到峰值，且CRP 水平与烧伤面积（burn surface area，BSA）呈正相关，其升高与烧伤患者感染及脓毒症的发生有关。

B.GÜLHAN 等[5]指出，火焰伤、血浆CRP 水平＞60 mg/L 和BSA＞25%都是烧伤患儿发生脓毒症的高危因素，与早先一项纳入918 例烧伤儿童的队列研究[6]一样，CRP 水平与严重烧伤患儿BSA 呈正相关；烧伤后第2 天起，死亡组患儿血浆CRP 水平明显高于脓毒症存活组，即烧伤患儿血浆动态CRP 水平和死亡事件显著相关。尽管如此，CRP 被证实在创伤、外科手术后、组织坏死、细菌感染及非细菌感染刺激下均可快速上升，其作为机体炎症反应水平指标固然有广泛适用性，对脓毒症的发生进行除外性诊断也有一定的可靠性，但对于烧伤患儿脓毒症发生与非感染所致炎症进行区分的特异性不高，且不能反映感染的严重程度，对烧伤脓毒症患儿预后的判断价值也十分有限[7]。

1.2 白细胞介素（interleukin，IL）IL-6 是一种由免疫细胞及多种相关细胞产生的具有多效性的细胞因子，是参与机体炎症反应细胞因子的核心成员，其血浆水平的急剧增高是一种危险的信号。血浆IL-6 水平在患儿烧伤发生后早期即可达到峰值，烧伤脓毒症患儿血浆IL-6 水平明显高于非脓毒症烧伤患儿，此后缓慢下降至正常水平；烧伤死亡组IL-6 水平在烧伤后亦始终高于脓毒症组，且在死亡事件发生前无下降趋势[8-9]。表明血浆IL-6 水平对烧伤患儿脓毒症及其严重性有较好的早期预警作用。

作为应对损伤及感染的急性时相炎症介质，IL-8在机体受到损伤之后参与中性粒细胞的活化和组织修复机制（如细胞增殖和血管生成）以及炎症的发生发展过程。在烧伤患儿，高水平的IL-8 与烧伤脓毒症、多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）和死亡事件发生有高度相关性，许多研究[8，10]也证实了其对烧伤患儿感染的诊断效能。此外，一项纳入468 例严重烧伤儿童60 d 内血浆IL-8 水平走势的前瞻性研究[11]甚至指出，血浆IL-8 水平达0.234 g/L 对烧伤患儿死亡事件预测具有最大的灵敏性和特异性。

烧伤使机体产生的大量细胞因子是烧伤患者SIRS 状态产生的基础[12]，故不少针对烧伤脓毒症的治疗如乌司他丁、血液净化及创面负压吸引和早期切痂等已经将IL-4、IL-6、IL-8 等作为判定脓毒症治疗效果的依据。此外，血浆肿瘤坏死因子α、IL-10 等炎症因子水平尽管在成人和小儿烧伤的不同时期均呈现出差异性，但对烧伤脓毒症的早期诊断和预后评估价值尚颇有争议[8，13]，需进一步探究。实际上，由于检测试剂的价格较高，上述细胞因子主要用于研究，在烧伤脓毒症早期诊断的临床应用尚未能普及。

1.3 降钙素原（procalcitonin，PCT）PCT 是降钙素的前体，生理状态下是主要来源于甲状腺滤泡旁细胞，由116 个氨基组成的多肽，其半衰期短（25～30 h），健康人群血清PCT 水平低。细菌感染刺激非内分泌细胞中其编码基因CALC-1 转录，从而导致PCT 产生增加。细菌感染事件3 h 内PCT 水平即升高，发生脓毒症起始的2～4 h 内可增加甚至1 000 倍，20 h 左右达到峰值。感染得到控制后，血浆PCT 水平每天下降约50%，是目前较为经典的脓毒症标志物[14-15]。

由于诊断标准不统一，成人烧伤群体发生脓毒症的PCT 临界值为0.5～3 ng/mL[16-17]，近年来血浆PCT 水平在儿童烧伤群体已经有一定的研究。入院时PCT 水平在非感染性烧伤患儿与烧伤脓毒症患儿中存在明显差异，且与患儿烧伤总面积大小、血培养阳性率、抗生素的依赖程度及重症监护时间明显呈正相关。死亡组患儿PCT 水平在烧伤后迅速升高，明显高于烧伤脓毒症存活组并始终保持较高水平，具有优于CRP 等其他标志物的预测价值[18]。M.F.KUNDES 等[19]研究发现，PCT＞0.5 ng/dL 对烧伤脓毒症患儿早期诊断具有100%的灵敏性和83%的特异性。此外，PCT 对细菌性脓毒症的发生尤为敏感，对病原体具有区分意义，且PCT 动态水平被证实在烧伤感染的治疗过程中展现出良好的抗生素指导作用[20]。可见，PCT 对烧伤患儿脓毒症的发生发展及临床治疗具有良好的临床指导意义。

2 儿童烧伤群体具有探索价值的蛋白类烧伤脓毒症早期标志物

由于烧伤患者病理生理的复杂性，单一生物标志物难以尽早而精确判断烧伤脓毒症的发生及其预后，脓毒症标志物联合诊断能提高早期诊断的灵敏性和特异性[21]。近年研究[22]表明，下述标志物在成人烧伤群体显示出一定的烧伤脓毒症早期诊断和严重性评估价值，但在小儿烧伤群体中的研究报道尚少，进一步展开研究实属必要。

2.1 肾上腺髓质素（adrenomedullin，ADM）及其前体中间片段（mid-regional proADM，MR-proADM）ADM是具有52 个氨基酸的肽，胚胎发育时期和成年时期的大多数器官、组织均表达ADM，尤其在内皮细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞和白细胞等表达量较高，此外，在血供丰富的器官或组织，如胎盘、肺、心脏、肾上腺髓质和脂肪组织也少量表达。但ADM 半衰期只有20 min，其MR-proADM 因更稳定、易测量而更多被用于间接反映其血浆水平。近年来研究[23]认为血浆ADM 及其前体对脓毒症的早期诊断率及预后评估有极大帮助，且能对不同程度器官功能障碍进行预后风险分层。血浆MR-proADM 对脓毒症诊断具有较好的灵敏性，联合运用血浆PCT 则可以显著提高脓毒症的早期诊断率[24]。昆明医科大学魏星等[25]最早指出，烧伤脓毒症患儿血浆pro-ADM 含量早期上升，其含量与全身炎症反应、靶器官损伤程度高度一致，与烧伤患儿序贯性器官衰竭估计（sequential organ failure assessment，SOFA）评分极大相关，其对于轻症脓毒症及部分病原体的鉴别可能要优于PCT。由于报道尚少，ADM 及其前体在烧伤感染早期诊断的价值还有待研究证实。

2.2 CD64 中性粒细胞（neutrophil CD64，nCD64）CD64是IgG 的FC 受体之一，属免疫球蛋白超家族成员，主要分布于单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞表面。nCD64 上调也一直被认为是对感染免疫反应的早期步骤。nCD64 在烧伤患者脓毒症组、局部感染组和非细菌感染对照组中表达依次降低且有明显差异性，被证实比CRP 和中性粒细胞、血小板等其他血液学检测方法具有更高的灵敏性[26-27]，表明nCD64 有望成为烧伤脓毒症新的早期诊断标志物。尽管中性粒细胞数量和功能在不同年龄段小儿略有差异，nCD64在感染发生时的表达尚未发现有年龄差异性，故而在小儿烧伤患者中展现出良好的应用前景。

2.3 CD14 亚 型（sCD14-ST，presepsin）CD14 是脂多糖（lipopolylysaccharides，LPS）-脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）复合物的受体，可以激活炎症级联反应和信号转导途径，在LPS引起的全身性炎症反应、内毒素休克等病理反应中起到重要作用。可溶性CD14 的蛋白酶切割的产物sCD14-ST（soluble CD14 subtype），后来命名为presepsin，同样被发现对SIRS 和脓毒症的鉴别诊断中比CRP、PCT 等展现出更好的特异性和灵敏性，对革兰阴性菌感染具有独到的优势，尤其对早产儿脓毒症发生的早期诊断作用已得到肯定[28-29]。已经证实presepsin 对烧伤脓毒症的诊断价值，在烧伤感染病原体的鉴别和抗生素使用方面也有一定的帮助，对烧伤患儿发生感染的早期诊断具有可行性。

2.4 高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）作为一类非组蛋白染色体结合蛋白，高迁移率族蛋白（high mobility group protein，HMG）广泛分布于真核生物细胞核内，对转录、复制、DNA修复和核小体形成等一系列过程中起着重要的调节作用。内毒素刺激等病理情况下，HMGB1 由胞核主动或被动分泌至胞外与Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）2 及TLR4 等结合发挥其炎症介质作用，在自身免疫性疾病、肝癌、脓毒症的发生发展中具有重要地位[30]。成人烧伤后7～21 d 脓毒症组患者外周血HMGB1 水平显著高于未并发脓毒症组，且在伤后3～21 d，脓毒症存活组的HMGB1 水平显著低于死亡组[31]。除了诱导脓毒症和MODS 的发生，HMGB1趋化中性粒细胞和单核巨噬细胞向炎症向创面的迁移，有助于吞噬和清洁烧伤组织释放的坏死组织和毒素、激活人微血管内皮细胞，与创面愈合及瘢痕形成相关[32]。故尽管HMGB1 是晚期炎症介质，生物学功能作用机制多样复杂，其表达量却与烧伤脓毒症的发生发展及其预后以及治疗显著相关，不失为一个良好的烧伤感染标志物研究方向。

3 分子类脓毒症诊断标志物及蛋白质和代谢组学在烧伤领域展现出良好的应用前景

3.1 分子类脓毒症标志物与烧伤脓毒症的早期诊断 基于对脓毒症病理生理的进一步认识和相关技术的提高，寻找更为敏感和特异的生物标志物在分子生物学领域取得较多发展，并展现出广阔的应用前景。

循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）自上世纪40 年代被发现可存在于机体外周血以来，后续研究[33]表明人体处于特殊状态（如炎症、肿瘤、妊娠等）时，外周血中cfDNA 含量急剧上升并存在点突变、DNA 甲基化及微卫星不稳定等基因改变。目前已广泛应用于肿瘤监测、炎症、创伤性、自身免疫性疾病及产前诊断等的病理生理评估。刘潇等[34]证实烧伤患者cfDNA 与MODS 评分及凝血功能等生化指标显著相关，可对烧伤患者严重程度及预后进行评估。

在基因组学方面，研究[35]已经发现了多种与感染易感性和脓毒症有联系的基因组变异，大多是涉及病原菌检测及炎症介质相关物质如TLR4、TLR2及CD14 的基因多态性。其中，血浆纤溶酶原激活物抑制剂1 及CD14-159C/T 等位基因等与烧伤患者较高的脓毒症及死亡风险有关[36-37]。

单个炎症因子的基因表达分析在烧伤脓毒症的发生发展中受到一定的研究，IL1、IL-6、IL-8、IL-10等的基因表达被证实在烧伤脓毒症的早期诊断及严重性评估方面展现出应用前景[38]。此外，除DNA甲基化外，非编码RNA 的失调、基因沉默和增强等表观遗传学改变也均与严重的炎症和脓毒症密切相关[39]。

3.2 蛋白质和代谢组学的应用价值 严重烧伤使机体产生复杂的病理生理过程，导致体液中蛋白质和酶水平的多种变化。蛋白质组学和代谢组学能进行高通量和大规模的蛋白质及其他代谢物质分析。基于高效液相色谱分离及质谱分析等方法发现脓毒症患者血清多种蛋白质及其他代谢物水平的上升及下调[40]；研究[41-42]也表明蛋白质和代谢组学相关数据可以用来区别感染性休克患者与没有感染的SIRS反应。故继基因和转录组学之后，蛋白质和代谢组学的兴起为更具灵敏性和特异性脓毒症标志物的鉴定提供了帮助，可能是将来开发更好的新型烧伤生物标志物的关键。

众所周知，对临床症状不典型、病情进展迅速急需早期诊断和干预的小儿烧伤脓毒症群体来说，因为家长的疼惜，检验标本常难以获取，更具灵敏性和特异性的诊断标志物能显示出绝对的优越性和适用性。尽管已经取得长足进步，上述分子类及蛋白质和代谢组学标志物诊断方法在小儿烧伤群体中的应用涉足尚少，在感染和脓毒症早期诊断的深层次机制和可行性也需要更多的探索。