中性粒细胞胞外诱捕网在脓毒症发生发展中的研究进展

古家润，彭国璇，张安强，邓 进，夏 飞

1.贵州医科大学附属医院急诊外科，贵阳 550004;2.贵州医科大学临床医学院，贵阳 550004;3.陆军军医大学大坪医院，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 400042

脓毒症是一种由病原体侵袭机体导致免疫功能紊乱的综合征，常常伴有炎症相关性损伤和多器官功能障碍等严重临床表现[1]。据统计[2]，全球每年有超过1 800万严重脓毒症病例，病死率高达30%～70%，脓毒症已逐渐成为重症监护病房内非心脏病患者死亡的主要原因。中性粒细胞是人类含量最丰富的白细胞，可激活脓毒症发生过程中固有免疫调节[3]。大量研究证明[4-5]，中性粒细胞的趋化、吞噬和杀菌作用参与了脓毒症多器官功能衰竭进程，具体作用机制复杂。在脓毒症发生时，病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)或损伤相关分子模式(damage-associatedmolecularpattern，DAMP)可以激活中性粒细胞的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)，活化的中性粒细胞释放游离DNA(cell free DNA,cfDNA)并镶嵌瓜氨酸化组蛋白(citrullinated histone3，Cit-H3)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)等共同组成的网状物质，即中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)[5]。NETs可以捕获并杀灭病原微生物，发挥炎症防御反应[6]。然而，NETs中包含的DNA和蛋白质对免疫细胞、内皮细胞的过度刺激作用，随着NETs的广泛形成可能会导致炎症和组织损伤的持久存在，并且过量的NETs会损害微循环，参与凝血级联反应，促进脓毒症微血栓形成，导致多器官功能衰竭[7]。因此，NETs的双向调节既能促使病原体的清除，但功能亢进时也能造成组织损伤并导致多器官功能衰竭[8]。本综述拟总结中性粒细胞NETs在脓毒症发生发展过程中的作用机制，以期为脓毒症治疗提供理论依据。

1 NETs的形成及炎症调节作用

NETs形成过程被称为“NETosis”，最初被认为是中性粒细胞不同于细胞坏死和凋亡的一种特殊的细胞死亡形式，被称为自杀性中性粒细胞胞外诱捕网形成(“suicidal NETosis”)，2004年被Brinkmann等[5,9]首次发现。细菌、病毒、真菌等病原微生物、佛波脂(phorbol myristate acetate,PMA)等化学物质以及干扰素、白介素8等细胞因子可激活NETosis，活化的中性粒细胞通过PKC/Raf/MEK/ERK信号传导途径增加NADPH氧化酶以产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)并增加钙离子流入，激活肽基精氨酸脱氨酶4(peptidyl arginine deaminase 4，PAD4)，进而诱导组蛋白精氨酸残基瓜氨酸化，导致核DNA解聚以及核膜破裂，释放解聚核DNA，结合胞质蛋白，包括NE、MPO、Cit-H3等抗菌蛋白，最后破坏质膜，释放到胞外环境中形成NETs，此过程发生时，NE和MPO迁移到细胞核，促进组蛋白的裂解，参与核DNA解聚[10-12]。

随着研究的深入，发现中性粒细胞释放NETs后仍存在保持细胞活性及功能的形式，称为非裂解性中性粒细胞胞外诱捕网形成(“vital NETosis”)。“vital NETosis”相较于“suicidal NETosis”更加迅速，仅持续30min左右，而“suicidal NETosis”通常需要3h左右[13]。“vital NETosis”包括核DNA和线粒体DNA两种形式。中性粒细胞受到刺激后，核DNA NETosis依赖血小板-中性粒细胞相互作用。中性粒细胞通过与血小板Toll样受体 4(toll-like receptors 4,TLR 4)、Toll样受体 2(toll-like receptors 2,TLR2)相互作用，核膜形态发生变化，以允许囊泡萌发，这些含有核DNA的小泡穿过细胞质与质膜结合，并在细胞外释放，形成NETs[14]。NETs释放后，这些中性粒细胞仍然能够保持趋化性和吞噬细菌等功能。线粒体DNA NETosis需要粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或补体因子5a(complement factor 5a，C5a)参与，该过程以ROS依赖性的方式产生，并且不会导致细胞裂解死亡，其具体过程尚不清楚[15]。见图1。

2 NETs的抗菌作用

NETs特有的网状结构及镶嵌的抗菌蛋白使得NETs具有捕获和杀灭包括细菌、病毒和真菌等病原微生物的作用。Buchanan 等[16]使用表达脱氧核糖核酸酶 (deoxyribonuclease，DNase) 的A 组链球菌处理坏死性筋膜炎小鼠模型，他们发现用表达 DNase 的菌株处理的小鼠皮肤损伤更严重、细菌感染范围更大，这表明NETs可以杀灭细菌并限制感染扩散。 Jenne等[17]通过静脉注射痘病毒处理小鼠，发现肝脏中NETs形成增加并保护宿主细胞免受痘病毒侵害，他们强调了NETs在预防病毒感染方面的作用。Silva等[18]发现中性粒细胞响应烟曲霉释放NETs并抑制其孢子萌发，表明NETs让宿主在烟曲霉菌等真菌感染中受益。然而，一些病原微生物进化出了逃逸机制以抵抗NETs的捕获。例如，Paracoccidioides brasiliensis释放一种 DNase 样蛋白，可破坏DNA结构，从而抵抗NETs捕获，导致炎症的发生[19]。

3 NETs介导脓毒症器官功能障碍

3.1脓毒症中NETs介导组织损伤 在脓毒症发生时，NETs可以捕获并杀灭病原微生物。然而，NETs中包含的DNA和蛋白质对免疫细胞、内皮细胞的过度刺激作用，随着NETs的广泛形成可能会导致炎症和组织损伤的持久存在。研究发现，脓毒症患者循环中过量的NETs成分，包括cfDNA和组蛋白，与多器官功能衰竭密切相关[20]。在脓毒症小鼠模型中，利用外源性DNase增加cfDNA的清除率，可有效改善脓毒症小鼠器官损伤并提高生存率[21]。同时，研究表明cfDNA可诱导肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎症因子表达升高，参与脓毒症免疫反应[22]。这些数据表明，cfDNA与脓毒症炎症反应和组织损伤密切相关，但确切机制尚不清楚。

NETs释放组蛋白占所含蛋白的70%左右[23]。组蛋白作为强力抗菌因子的同时，亦作为趋化因子诱导免疫细胞死亡、促进炎症因子释放，并具有直接细胞毒性作用来诱导组织损伤[7]。给予小鼠外源性组蛋白，可导致白介素6和 TNF-α等炎症因子表达增加，并损伤组织细胞[24]。人类内皮细胞体外研究发现，胞外组蛋白具有直接细胞毒性，可诱导ROS来调节一氧化氮的产生，从而直接导致内皮功能障碍[25]。以上结果说明，NETs的过度激活会导致组织损伤，与脓毒症器官功能障碍密切相关。

3.2脓毒症中NETs介导凝血功能障碍 凝血系统和抗凝系统通常处于动态平衡，但脓毒症期间全身炎症反应会导致凝血系统异常激活形成血栓，使血小板减少、凝血因子耗竭，最终可发展为弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC),并导致多器官功能衰竭。研究发现，脓毒症期间中性粒细胞NETs与血栓形成密切相关，包括血管内皮细胞损伤和血小板-中性粒细胞相互作用。

血管内皮受损在脓毒症血栓形成中起重要作用。脓毒症期间，中性粒细胞被募集到感染和损伤部位并释放NETs。NETs通过白介素1α 和组织蛋白酶G的协同作用促进血管内皮细胞的激活并增加血栓形成[26]。同时，NETs以剂量依赖的方式诱导血管内皮细胞的死亡，并通过TLR4/NF-κB信号通路促进内皮细胞中炎症因子的释放，促进炎症反应[27-28]。总之，NETs参与并放大了与脓毒症血栓形成相关的血管内皮细胞损伤。

血小板是免疫血栓形成的关键效应细胞。脓毒症期间，血小板和中性粒细胞相互作用促进NETs参与先天性免疫反应[29]。通过LPS处理的小鼠中性粒细胞释放大量NETs，然而相同剂量的LPS条件下，血小板耗竭的小鼠则不会发生这个过程，表明脓毒症中NETs的释放高度依赖血小板-中性粒细胞的相互作用[30]。血小板通过P-选择素与中性粒细胞受体P-选择素糖蛋白配体-1(P-selectin glycoproteinlig-1， PSGL-1)相互作用诱导脓毒症NETs[31]。被激活的血小板释放多种细胞因子，包括高迁移率族蛋白1(high mobility group box1，HMGB1)、血小板因子4(platelet factor 4，PF4)、趋化因子CXCL4和趋化因子(CCL)，调节中性粒细胞NETs。HMGB1是一种DAMP，通过与晚期糖基化终产物(receptor of advanced glycation endproducts，RAGE)受体结合，激活中性粒细胞NETs[32]。血小板衍生因子PF4、CXCL4和CCL5可通过中性粒细胞G蛋白偶联受体诱导中性粒细胞NET[33]。LPS也可以通过TLR4或TLR2受体激活血小板-中性粒细胞相互作用诱导NETs[34]。同时，中性粒细胞NETs可以促进血小板黏附、活化、聚集，并为血栓形成提供支架，形成恶性循环，导致血小板的过度耗竭和小血管闭塞，最终可发展为DIC[35]。

3.3NETs作为脓毒症潜在的治疗靶点 尽管NETs表现出一定的抗菌效应，但越来越多的研究发现NETs的过度产生会导致炎症反应失调和凝血功能障碍，与脓毒症多器官功能衰竭密切相关。因此，以NETs作为新的治疗靶点有望成为脓毒症免疫治疗的新策略。

通过中和NETs成分，增加NETs清除。研究发现，使用DNase治疗脓毒症小鼠，可减少循环中cfDNA的含量，增加NETs的清除，有效减轻多器官功能障碍并提高小鼠生存率[19,34]。NETs的主要成分之一Cit-H3作为一种DAMP，有直接细胞毒性、促炎和促进血栓形成的特点，因此可作为脓毒症潜在的分子靶标。研究证实，中和脓毒症小鼠循环中Cit-H3，可有效减轻脓毒症小鼠肺损伤并提高生存率[36]。

减少NETs形成。鉴于PAD4在脓毒症介导中性粒细胞NETs中的重要作用，靶向PAD4似乎是减少中性粒细胞NETs的有效途径。通过PAD4基因缺陷小鼠脓毒症模型发现，PAD4缺乏可减轻NETs介导的血管内皮损伤和器官功能障碍[37]。但抑制PAD4基因表达的长期病理生理表现尚不清楚，因此以PAD4作为治疗靶点开发药物仍存在巨大挑战。

4 总结与展望

脓毒症目前仍是危重症领域的治疗难点，其发生发展复杂，常合并多器官功能障碍，导致其病死率居高不下。中性粒细胞NETs在其中发挥“双刃剑”作用。在脓毒症早期，中性粒细胞NETs捕获和杀灭病原体的能力可有效限制感染扩散，减缓脓毒症的进程。但随着中性粒细胞NETs的广泛形成会造成组织损伤以及凝血功能障碍，与脓毒症多器官功能衰竭密切相关。因此，中性粒细胞NETs的动态平衡对限制脓毒症的进展似乎有重要作用。在不损害中性粒细胞NETs抗菌功能的前提下，减少NETs的过度生成或加速NETs的清除，维持NETs的动态平衡有望成为脓毒症治疗的新策略。

作者贡献说明：古家润：文章选题、撰写；彭国璇、张安强、

邓进：文献查阅;夏飞：文章选题