解痉多肽表达化生动物模型的研究进展*

陈万群，张金卫，罗 杨 综述，杨小军△ 审校

(重庆市中医院：1.消化科；2.皮肤美容科 400021)

胃腺癌作为世界范围内高致死率的肿瘤之一，其中幽门螺杆菌(helicobacter pylori,Hp)感染被认为是其发生、发展最重要的危险因素[1]。持续的感染及慢性炎症导致胃癌前病变患者出现泌酸腺体缺失，即形成慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)[2]。CAG表现为胃单位的重组，即以峡部胃单位(胃小凹和深部胃窦细胞之间)胃祖细胞的增殖，以及胃腺体基底部有丝分裂后的主细胞重组成为增殖的化生细胞[3]。胃单位重组形成慢性萎缩被称为解痉多肽表达化生(spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia,SPEM)[4]，这种化生形式具有进化保守性，可导致近端胃单位(如胃窦)的短暂性改变，进而使得其在应对深部腺体损伤条件下，具有修复及重组为正常胃黏膜结构的功能[5]。但是在某些条件下，重组被中断后持续的SPEM可以进展到异型增生[6]。

既往动物研究证实肠化生(intestinal metaplasia,IM)起源于SPEM，其中某些研究发现造模方式不同也会导致SPEM的进展不同，如Hp感染所致的SPEM仅进展到异型增生，而不会进展至IM，但这些研究均证实SPEM为癌前级联反应的初始步骤[3,6-8]。目前国内胃癌前病变动物模型研究鲜有涉及SPEM，本文就SPEM动物模型做一综述。

1 DMP-777诱导的缺乏炎症的SPEM模型

为了构建泌酸腺体萎缩模型，在2000年，GOLDENRING等[9]开展了DMP-777 诱导的可逆性泌酸腺体萎缩的研究，即单独以该试剂处理小鼠特定时间后胃黏膜可自行恢复。DMP-777是一种具有选择性的人白细胞弹性蛋白酶抑制剂，通常以浓度2%悬浮在0.5%的甲基纤维素的溶液中。研究证实DMP-777可导致特定壁细胞缺失，胃小凹增生而致使正常腺体细胞系缺乏。

有研究发现DMP-777处理小鼠在2 d内即可导致壁细胞的快速缺失，予野生型小鼠连续灌胃7 d，在腺体基底部即可出现表达解痉多肽(Trefoil factor 2，TFF2)的黏膜细胞系化生——SPEM；而在敲除胃泌素小鼠中，灌胃1 d即可形成在蛋白及核酸水平均阳性表达TFF2的SPEM；经DMP-777处理14 d后，敲除胃泌素小鼠继续予以戒断DMP-777为期14 d的观察，SPEM仍持续存在，故可得出SPEM形成依赖于胃泌素[10]。该团队后续又对上皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是否调节泌酸腺体萎缩的化生应答进行了相关研究，分别予敲除双调蛋白、转化生长因子α及其野生型小鼠DMP-777灌胃，灌胃时间及药物恢复期均为14 d，结果发现敲除双调蛋白可促进泌酸腺体萎缩，SPEM及IM的形成[8,11-12]。因DMP-777诱导SPEM具有自身特点，仍在近期研究中与其他几种造模方式形成模型对照，以研究主细胞化生机制[13]。

2 Hp或猫螺杆菌(H.felis)感染小鼠形成慢性炎症的动物模型

Hp感染引起慢性浅表性胃炎并可进展至慢性萎缩性胃炎、肠化、异型增生甚至胃癌，现有研究主要通过Hp或H.felis注射、灌胃或者与黏膜共培养形成相关模型。研究证实H.felis可加速C57BL/6小鼠胃黏膜萎缩、细胞凋亡及改变细胞系分化[14-15]。抑酸及Hp感染均可导致高胃泌素血症，有研究发现胰岛素-胃泌素转基因小鼠在20月龄时表现为胃黏膜化生、异型增生、原位癌及具有血管浸润的胃癌，而H.felis感染的胰岛素-胃泌素转基因小鼠可进一步加速黏膜内肿瘤的发生(85%)，黏膜下肿瘤浸润(54%)及血管内浸润(46%)，说明H.felis感染对化生、异型增生及肿瘤形成具有重要作用[16]。

此后，又有研究缩胆囊素/胃泌素受体及组胺H2受体信号通路在胃黏膜萎缩和胃癌中的作用，证实缩胆囊素/胃泌素及组胺H2受体拮抗剂具有协同抑制H.felis感染的胰岛素-胃泌素转基因小鼠模型胃黏膜萎缩和胃癌形成的作用[17]。另有研究发现Hp感染早期即形成SPEM，腺体改变起源于持续感染Hp的SPEM腺体中，即由SPEM继发IM[7]。同样，使用H.felis感染C57BL/6小鼠6个月可形成SPEM模型，证实SPEM为癌前初始步骤，SPEM为进展至异型增生乃至胃癌的关键阶段[18]。因Hp或H.felis感染所致的SPEM模型基本可模拟人体的SPEM形成过程，故与人体临床标本对照可用于研究SPEM腺体细胞的遗传不稳定性[19]。

3 L-635形成快速诱导的具有炎症应答的SPEM小鼠模型

由于DMP-777可抑制中性粒细胞弹性蛋白酶，在早期固有免疫应答阶段阻止炎症应答，因此DMP-777形成的壁细胞缺失的SPEM模型缺乏炎症应答。而人体内化生的形成均在一系列炎性反应的条件下产生，为了形成具有炎症的新型的壁细胞缺失的SPEM模型，有研究者用德国默克公司合成的结构性相关的β内酰胺复合物，该复合物可以保持壁细胞质子载体潜在的活性，但却不会攻击中性粒细胞弹性蛋白酶。予C57BL/6小鼠连续灌胃3 d后，TFF2、内因子均阳性表达的SPEM模型快速形成，这一模型再次证实炎症和壁细胞缺失共同构成SPEM。

在前期研究基础上，研究者比较了DMP-777、L-635及H.felis诱导的SPEM模型，结果发现，3种不同的造模方式均可形成SPEM，至少是主细胞的部分转化，L-635造模的特点为快速形成具有炎症应答的主细胞转化的SPEM模型[3]，缺点是合成L-635价格昂贵，不易获得，在一般实验室难以得到推广。使用前面所述的3种造模方式，研究发现凝集素(clusterin)在3种不同方式造模小鼠中均异常升高，而囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)仅在具有炎症表达的模型中表达升高，在人胃黏膜中，CFTR在肠化组织而非SPEM中表达[20]。由于L-635与DMP-777形成的SPEM存在炎症有无的差别，故研究炎症细胞通路在SPEM生成的作用可利用此两种不同的造模方式，作为良好的对比模型，IL-33/13细胞因子信号通路在化生中的作用得到证实[21]。此后，基于该信号通路，后续研究发现外源性给予IL-33可使正常小鼠诱导SPEM形成[22]。由此看出，随着SPEM形成机制的深入研究，未来SPEM构建模型将出现多样化趋势。

4 Tamoxifen诱导的急性SPEM小鼠模型

由于DMP-777所致SPEM模型缺乏炎症应答，L-635价格昂贵而不易获得，H.felis诱导的SPEM造模时间长且可能伴有异型增生乃至胃癌，故探索新型的造模剂极为迫切。Tamoxifen是一种广泛使用于临床与研究的选择性雌激素受体调节剂，研究发现予Tamoxifen≥3 mg/20 g正常小鼠体重3 d，即可导致超过90%胃壁细胞凋亡及酶原主细胞化生，且胃组织可在3周后恢复正常[23]。这一造模方式成为目前研究SPEM最常用的造模方式，并形成了相关方法学文献指导，使得这一造模方式具有均一、可重复验证而得以推广[24]。

鉴于Tamoxifen造模的稳定性，借助此模型开展了对SPEM相关炎性因子如白细胞介素-10(IL-10)的研究[25]，急性药物及慢性炎症所致胃黏膜损害所致SPEM的单细胞转录分析[26]。构建此项模型后，同样也为研究Hp与化生改变之间的关系创造了良好条件，将Tamoxifen诱导的急性SPEM小鼠胃黏膜形成自由浮动的组织块，与Hp共培养后证实，不管在人还是小鼠SPEM腺体中，均可通过路易斯抗原(sialyl-Lewis X，sLex)连接[27]。同时，为了研究颈黏液细胞、主细胞及SPEM细胞在小鼠中增殖和分化模式，最新研究在使用Tamoxifen及Hp诱导形成胃黏膜损害的同时，予以溴尿苷作为诱变剂进行干预，进一步对稳态或化生诱导的胃黏膜损害的细胞增殖和分化进行了研究报道[28]。以SPEM为代表的各类化生究竟如何增加致癌的风险，为了研究这一问题，有研究者将C57BL/6小鼠共同饲以高剂量Tamoxifen及雷帕霉素，在诱导SPEM同时可阻滞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白敏感型复合体(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)活性，并让小鼠自由饮用含亚硝基脲的水诱导胃癌形成[29]。

随着对SPEM机制研究的深入，近期研究倾向于将多种模型对比使用或联合使用，或联合使用关键基因、蛋白敲除小鼠等复合形成动物模型，或加用其他化学药物，以达到验证既定研究假设的作用[29-31]。如使用DMP-777、L-635、H.felis之间形成不同对照模型，研究主细胞转化的机制[32]。或者为了研究特定蛋白对SPEM的影响，使用敲除该蛋白如人附睾蛋白4(human epididymis protein 4,HE4)基础上，分别使用DMP-777、L-635、高剂量Tamoxifen诱导的SPEM模型，以研究HE4蛋白在胃癌形成中的作用[33]。

5 脱氧胆酸(deoxycholic acid，DCA)刺激巨噬细胞源外泌体促进SPEM形成

DCA作为一种对人类有害的次级胆汁酸，有研究证实其可促进肠化生标记物的表达。基于此，有研究者将6周龄大的C57BL/6雄性小鼠随机分成正常对照组(无菌水灌胃)、DCA组(100 μmol/L DCA溶于无菌水中)，两组中每只小鼠每天用200 μL无菌水灌胃(含或不含DCA)，4周后收获胃黏膜标本，荧光免疫检测SPEM标记物TFF2、GSⅡ外源凝集素，结果显示此种造模方式同样可形成SPEM[34]。但此种造模方式目前仅有一个研究采用，其稳定性尚待更多研究予以证实。

6 总 结

综上所述，不管药物诱导还是Hp或H.felis感染均可形成SPEM模型，但因不同药物及Hp或H.feli感染的不同特性，使得诱导模型具有自身特点，均可为目前研究SPEM生成及进展机制使用。研究者可根据研究目的选择相应造模方式，同时由于各个模型的自身局限性，开展不同模型进行对照研究可以较好揭示SPEM在胃癌前病变中的作用机制。