丝素蛋白/氧化石墨烯纳米纤维膜的制备与性能

程若冰，何一强，唐嘉俊，杨雨欣，刘欣玥，罗袁俊，张葵花

(嘉兴学院:a.分析测试中心；b.材料与纺织工程学院，浙江嘉兴314001)

丝素蛋白(SF)是一种从蚕茧中提取的天然蛋白质，由于其具有良好的生物相容性、生物可降解性、良好的透氧透气性及无免疫原性而被广泛用于生物医学领域.[1]静电纺丝纳米纤维能仿生天然细胞外基质的结构，具有高比表面积、高孔隙率，是理想的组织工程支架材料.[2]本文在前期工作中，以丝素蛋白以及丝素蛋白与壳聚糖、透明质酸、聚乳酸聚己内酯共聚物等共混后制备的纳米纤维都具有良好的生物相容性，能促进皮肤、血管及神经的再生.[3-5]氧化石墨烯(GO)是石墨烯的氧化衍生物，在水或某些极性溶剂中表现出良好的分散性，且由于其基面上的酚羟基和环氧基以及边缘的羧基而具有更好的亲水性，因此，细胞在GO基底上比在石墨烯基底上具有更好的黏附和增殖.[6]此外，GO底物能促进各种干细胞系的生长和分化，包括诱导多能干细胞(IPSC)、间充质干细胞(MSCs)和人类神经干细胞(HNSC).[7]

为了提高SF与细胞的相互作用，本文以水为溶剂，采用静电纺丝方法制备SF/GO纳米纤维膜，并用75%(V/V)的乙醇蒸汽进行后处理，使SF的构象从水溶性的无规卷曲结构转变成不溶于水的β-折叠结构，起到灭菌的作用.整个制备过程绿色环保、简单、无毒，SF/GO纳米纤维膜有望成为理想的组织工程支架和药物缓释材料.

1 实验部分

1.1 试剂

蚕茧(浙江嘉欣丝绸股份有限公司提供)；碳酸钠、氯化钙、高锰酸钾、硫酸、磷酸、双氧水(均为分析纯)、石墨粉末，均购于国药集团化学试剂有限公司；高糖培养基、胎牛血清、磷酸盐缓冲溶液、胰蛋白酶、噻唑蓝(MMT)，均购于杭州四季青生物工程材料有限公司；成纤维细胞株(NIH3T3)，购于中科院上海细胞库.

1.2 再生SF制备

将蚕茧在100 ℃且浓度为 0.5%(w/w) Na2CO3水溶液中煮3次，去除丝胶蛋白，37 ℃干燥后用三元溶剂[n(CaCl2)∶n(C2H5OH)∶n(H2O)=1∶2∶8(摩尔比)]在70 ℃状态下溶解1 h，冷却后用透析袋(250-7u,Sigma,美国)在去离子水中透析3天，冷冻干燥得到再生SF海绵.

1.3 SF/GO纳米纤维膜的制备

按照改进的Hummers法制备GO水分散液，[8]为了获得小尺寸单片状GO，用超声波破碎仪(超声波仪4000,Misonix,美国)超声破碎1 h后备用.

分别在浓度为0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1的GO分散液和去离子水中加入SF，配成30%(w/w)SF纺丝液进行静电纺丝.纺丝参数分别为电压：16 kV;纺丝速率： 0.8 mL·h-1;纺丝距离：15 cm.制备好的纳米纤维膜(SF、SF/GO-0.5,SF/GO-1.0)用75%(V/V)乙醇蒸汽进行后处理，真空干燥备用.

1.4 测试与表征

纳米纤维膜的形貌用SEM(S-4800，Hitachi，日本)观察，使用图像分析软件(Image-J)计算纳米纤维的平均直径.不同纳米纤维膜的衰减全反射(ATR-FTIR)光谱通过FTIR光谱仪(V70，Bruker，德国)测试.

1.5 吸水率的测定

将处理后的纳米纤维膜分别取质量相近的3块，放入培养皿中，加入一定量去离子水，在25℃水浴条件下吸水溶胀，再在规定的不同时间取出，用滤纸吸取纳米纤维膜表面的水分，然后在天平上称重，取3个样本的平均值.吸水率测定公式为：

吸水率=[(mn-m1)/m1]×100%

其中mn为吸水后质量，m1为原质量.

1.6 细胞增殖实验

将制备好的纳米纤维膜放入24孔板中，用钢环压住，用75%(V/V)乙醇蒸汽处理2 h，然后在超净台中吹干.将培养好的NIH3T3细胞以每孔1.0×104个细胞密度加入到24孔板中，并用玻片作为对照组.细胞增殖时间分别为1、3、6天，将经过一定时间培养的细胞，用MTT法测定其吸光值.

2 结果与讨论

2.1 SF/GO纳米纤维形貌观察

图1为SF/GO纳米纤维的SEM和直径分配图.从图1中可知，所有纳米纤维的形貌都是带状的，纯SF纳米纤维直径为908±189 nm.当加入不同量的GO后，纤维直径随着GO浓度增加而略有减小.根据文献[9]，GO为一维尺寸约140 nm、厚度14 nm的单片结构，带负电荷，平均zeta电位为-30.58±1.12 m.因此，GO的加入增加了SF溶液的导电性.在静电纺丝过程中，溶液导电性的增加将导致溶液拉伸强度增加，从而趋向于产生直径较小的纤维.[10]另外，由于GO纳米片上含有大量的羟基、羧基和环氧基团，能与SF分子链上氨基和羧基形成分子间氢键，导致喷丝口的溶液在高压作用下易劈裂成更小的射流，从而形成更小直径的纤维.[11]

图1 SF/GO 纳米纤维的SEM和直径分配图注：(a，a′)SF； (b，b′)SF/GO-0.5； (c，c′)SF/GO-1.0

图2为75%(V/V)乙醇蒸汽处理后的SF/GO纳米纤维的SEM图.

图2 75%(V/V)乙醇蒸汽处理后的SF/GO纳米纤维的SEM图注：(a)SF； (b)SF/GO-0.5； (c)SF/GO-1.0

由图2可知，和处理前相比，纳米纤维之间存在一定程度的粘结和变形.主要由于处理过程中，纳米纤维在乙醇分子的作用下发生溶胀，但是随着GO含量的增加，纤维间粘结程度越来越小，形貌基本不变，源于GO的加入增加了纤维的强度，有利于保持纳米纤维膜较高的孔径和孔隙率.

2.2 SF/GO纳米纤维的红外光谱分析

根据红外光谱特征吸收谱带的位置，可以分析分子间的相互作用和构象转变.当SF在1650～1660 cm-1(酰胺I)、1535～1545 cm-1(酰胺Ⅱ)、1230～1240 cm-1(酰胺III)处有特征吸收峰，表明SF构象为无规卷曲或α-螺旋(Silk I结构)；当SF在1625～1640 cm-1、1515～1525 cm-1、1234 cm-1和696 cm-1处有特征吸收峰，表明SF构象为β-折叠(Silk II)结构.[12]

图3为75%(V/V)乙醇蒸汽处理前后SF/GO纳米纤维的ATR-FTIR图.由图3可知，a和b的红外光谱图相似，其中酰胺I的特征吸收峰在1656 cm-1，酰胺II的特征吸收峰在1540 cm-1，表明SF构象主要为无规卷曲结构或α-螺旋(Silk I结构)，GO的加入对SF的构象没有明显的影响.而经过乙醇处理后SF及SF/GO-1.0纳米纤维的特征吸收峰在1635 cm-1和1518 cm-1处，分别向低波段移动了21 cm-1和20 cm-1，表明分子构象从易溶于水的无规卷曲结构转变为不溶于水的β-折叠结构.ATR-FTIR分析结果表明：GO不能诱导SF的构象发生变化，而75%(V/V)乙醇能诱导SF构象从无规卷曲转变为β-折叠结构.

2.3 SF/GO纳米纤维支架的亲水性

纳米纤维膜表面和内部的亲疏水性决定了纳米纤维膜在水中的吸水性能.图4为SF/GO纳米纤维膜在水中浸泡不同时间的吸水率.由图4可知，SF及SF/GO纳米纤维膜的吸水率在0～6 h内随浸泡时间的增加而增加，6 h后基本不变，其中SF/GO纳米纤维膜的吸水性能明显优于SF纳米纤维膜，且随GO量的增加而增加，这源于GO纳米片上含有大量的羟基、羧基和环氧基等亲水基团.[13]

图3 75%乙醇蒸汽处理前后纳米纤维ATR-FTIR图

图4 SF/GO纳米纤维膜浸泡不同时间的吸水率

2.4 SF/GO纳米纤维膜的细胞相容性

图5为成纤维细胞(NIH3T3)在SF/GO纳米纤维膜上培养1、3、6天的增殖情况.培养1天后，与玻片相比，细胞在纳米纤维膜上没有显著差异；培养3天和6天后，和玻片相比，增殖情况有明显差异，与SF纳米纤维膜相比，细胞在SF/GO纳米纤维膜的增殖明显优于在SF纳米纤维膜，并且随着GO量的增加细胞增殖情况更好，表明SF/GO纳米纤维膜具有更好的细胞相容性.

图5 成纤维细胞(NIH3T3)在SF/GO共混纳米纤维膜上培养1、3、6天的增殖情况注：(a)玻片；(b)SF；(c)SF/ GO-0.5；(d)SF/ GO-1.0； 显著性差异(*p<0.05)

3 结论

利用GO在水中具有很好的分散性和再生SF的水溶性，本文以水为溶剂，采用静电纺丝方法制备SF/GO纳米纤维膜，并用75%(V/V)乙醇蒸汽对纳米纤维膜进行后处理，得到不溶于水的SF/GO纳米纤维膜.结果发现，SF/GO纳米纤维的直径随着GO的量的增加略有减小，且乙醇蒸汽处理后，纳米纤维的形貌变化更小.相比SF纳米纤维膜，SF/GO纳米纤维膜具有更好的亲水性能和细胞相容性，有望成为组织工程的理想支架.