烟酸促进小肠RORγt+Tregs稳态的维持

耿钰鑫 陈正涛 张钟允 董波 古惠文 李欣雨 贾凌云 王新 孙方园 唐华，

1.山东第一医科大学（山东省医学科学院）医学科技创新中心，山东 济南 250117；2.山东第一医科大学（山东省医学科学院）实验动物学院（省实验动物中心），山东 济南 250117；3.山东第一医科大学第一附属医院（山东省千佛山医院），山东 济南 250013

肠道Foxp3+调节性T细胞（Foxp3+Treg）分为Helios+Treg、RORγt+Treg和Helios-RORγt-Treg 3个亚群，对肠道免疫稳态的维持发挥重要调控作用。RORγt+Treg是一群肠道菌群依赖的诱导性Treg，2011年Atarashi等［1］描述Helios-Treg亚群发育依赖于肠道菌群，而且共生梭菌属发挥重要作用，2013年Furusawa等［2］进一步发现，共生菌群的代谢产物可以诱导其分化发育，2015年两个课题组同时对这一细胞在肠道免疫稳态维持中的作用进行了描述［3-4］。研究发现，肠道菌群的代谢产物短链脂肪酸以及次级胆汁酸对肠道RORγt+Tregs的稳态具有重要调控作用［5-6］，是否还有其他肠道菌群的代谢产物也对RORγt+Tregs的维持具有重要调控作用目前尚不清楚。

烟酸属于维生素B族，又称为维生素B3，可由肠道菌群代谢产生［7］，Singh等［8］研究发现抗生素清除肠道菌群可导致肠道Treg稳态失调，而补充烟酸能够恢复肠道Treg的比例，但烟酸是否对肠道RORγt+Treg亚群的稳态维持有作用以及机制目前还不清楚。本研究通过给小鼠口服抗生素，破坏小肠固有层RORγt+Treg稳态赖以维持的菌群微环境，探讨口服烟酸对RORγt+Treg比例及增殖变化的影响，为肠道菌群紊乱导致的肠道炎症型疾病的预防及治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物SPF级雌性C57BL/6小鼠，6～8周龄，体质量18～20 g，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于山东第一医科大学生命科学研究中心SPF动物房。实验操作符合山东第一医科大学实验动物福利伦理审查委员会标准。

1.1.2 实验试剂与仪器 抗小鼠CD3e Biotin（eBioscience，13-0031-85），CD4-APC（Invitrogen，17-0041-82），CD8-APC-eFluor 780（Invitrogen，47-0081-82），Foxp3-PE（Invitrogen，12-5773-82），Helios-FITC（Invitrogen，11-9883-82），Ki67-PE-Cyanine7（Invitrogen，25-5698-82），GATA3-PerCP-eFluor 710（Invitrogen，46-9966-42），RORγt-BV421（BD，562894），BV650 Streptavidin（BD，563855），破膜固定液（Invitrogen，00-5223-56），Ⅷ型 胶 原 酶（Sigma，C2139-5G），Percoll细胞分离液（GE，17089101），新生牛血清（四季青，22011-8612），HEPES（SIGMA，H3537），EDTA（Invitrogen，15575-038），DTT（Solarbio，D8220），1640培 养 基（Cytiva，SH30809.01），万 古 霉 素（Meilunbio，MB1260-4），甲 硝 唑（Sigma-Aldrich，M3761），新霉素（Fisher Scientific，SR0163H），氨苄青 霉 素（Sigma-Aldrich，A5354），烟 酸（Sigma-Aldrich，72309），流式细胞仪（BD，LSRFortessa），水平离心机（Thermo Fisher，XIR），摇床（SHAKER INCUBATOR，TS-100B）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及给药C57BL/6小鼠共随机分为四组：对照组（Ctrl，n=5）正常饮水；抗生素处理组（VMNA，n=5）饮水中添加0.5 mg/mL万古霉素，1 mg/mL甲硝唑，1 mg/mL新霉素，1 mg/mL氨苄青霉素，连续饮水用药7 d；烟酸处理对照组（Niacin，n=5）饮水中添加终浓度为25 mmol/L的烟酸，连续饮水用药7 d；烟酸实验组（VMNA+Niacin，n=5）需同时在饮水中添加上述抗生素混合以及终浓度为25 mmol/L的烟酸，连续饮水用药7 d。

1.2.2 小鼠小肠单细胞制备 采用颈椎脱臼法处死小鼠，取出小肠，去除肠内容物、肠系膜以及派氏结，沿长轴剖开，放入PBS中涮洗干净，剪成数段放入缓冲溶液中；使用摇床220 r/min震荡20 min去除肠上皮，重复2次；将肠段转移到1.5 mg/mLⅧ型胶原酶中，37oC消化16 min，过滤离心；使用36%Percoll液1 400 r/min离心20 min，获得小肠固有层淋巴细胞。

1.2.3 流式细胞术染色方法 将获得的细胞计数，使用CD3e Biotin（1∶50）、CD4-APC（1∶200）、CD8-APC-eFluor 780（1∶100）、BV650 Streptavidin（1∶800）进行表面标记染色，标记死细胞后使用染色固定液固定30 min后，标记Foxp3-PE（1∶50）、Helios-FITC（1∶100）、Ki67-PE-Cyanine7（1：1600）、GATA3-PerCP-eFluor 710（1∶100）和RORγt-BV421（1∶100）60 min。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，实验数据均采用均数±标准差（xˉ±s）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两组间比较采用独立样本t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 抗生素处理导致小肠肠道固有层RORγt+Treg比例降低

使用广谱抗生素混合以及抗生素单独饮水处理C57BL/6小鼠后，流式细胞仪检测小肠固有层Treg细胞以及RORγt+Treg细胞亚群比例变化，结果显示，无论单独还是混合使用抗生素，小肠肠道固有层Treg细胞比例及相对数量均出现显著的升高或升高趋势（图1A）。进一步分析发现，抗生素混合处理组中菌群依赖的RORγt+Treg细胞亚群比例降低，差异有统计学意义（P＜0.05），而抗生素的单独使用对于这一亚群的影响较小或者没有影响（图1B）。

图1 C57BL/6小鼠饮水抗生素7 d后小肠固有层RORγt+Treg细胞的比例

2.2 烟酸恢复抗生素处理后小肠固有层RORγt+Treg的比例

为了研究菌群代谢产物烟酸在菌群缺失的情况下对小肠固有层RORγt+Treg比例变化的影响，本研究在上述联合抗生素组的饮水中添加烟酸，7 d后检测发现，抗生素处理下调了小肠固有层RORγt+Treg以及TH17的比例，差异有统计学意义（P＜0.05），而烟酸能够拯救因肠道菌群缺失导致的小肠固有层RORγt+Treg比例的降低，差异有统计学意义（图2B，P＜0.05），但对TH17则没有显著作用（图2C，P＞0.05）。使用流式细胞仪检测小肠固有层RORγt+Treg以及TH17的RORγt蛋白的平均荧光强度（median fluorescence intensity，MFI），结果显示，抗生素处理以及烟酸单独处理后两者MFI均降低，差异均具有统计学意义（图2D，P＜0.01），抗生素处理并补充烟酸后两者的MFI也没有出现显著的恢复（图2D，P＞0.05）。

图2 饮水中添加烟酸能够显著恢复联合抗生素组小肠固有层RORγt+Treg比例

2.3 烟酸恢复抗生素处理组小肠固有层RORγt+Tregs的增殖

为了验证烟酸是否具有促进RORγt+Treg增殖的作用，本研究检测了RORγt+Tregs细胞Ki67增殖蛋白的表达，结果显示，抗生素处理组中小肠固有层RORγt+Treg以及TH17细胞的Ki67蛋白表达水平下调，差异有统计学意义（P＜0.01），而添加烟酸后，与对照组相比表达Ki67的RORγt+Treg比例升高，差异有统计学意义（图3A，P＜0.01）。而对于小肠固有层的TH17，烟酸的补充并不能够恢复其增殖能力（图3B）。

图3 烟酸促进小肠固有层RORγt+Treg的增殖

3 讨论

小肠口服耐受的打破是导致机体食物过敏的原因之一［9］，人类肠道包含有将近1015个肠道共生菌，肠道菌群的组成影响肠道固有层内大多数免疫细胞亚群的稳态或功能［10］，这对机体食物过敏反应具有保护作用［11-12］。Treg是一类调控免疫稳态及免疫反应的T细胞亚群［13］，在食物过敏、自身免疫、炎症及微生物和肿瘤的免疫反应中具有重要作用。RORγt+Treg亚群主要存在于肠道固有层，其发育依赖于肠道共生菌群［14］，目前对于肠道共生菌群调控RORγt+Tregs的发育机制还不清楚。Ohnmacht等［3］研究发现，Toll样受体及NOD样受体家族均不参与RORγt+Treg亚群的发育，肠道菌群产生的“危险信号”可能并没有发挥作用。Smith等［15］研究发现，肠道微生物降解纤维素产生的短链脂肪酸可以显著诱导无菌小鼠肠道Treg的发育。研究发现，丁酸盐饲喂SPF小鼠4周，可以诱导RORγt+Treg亚群的发育［3］，而Sefik等［4］使用抗生素饮水处理2周后，再加入短链脂肪酸处理2～3周，发现并没有明显诱导RORγt+Treg亚群的发育，因此推测短链脂肪酸似乎并不是菌群影响RORγt+Treg发育的唯一因素。

GPR109a在肠道中作为丁酸及烟酸共同受体［16］，对抑制结肠炎和癌变有重要作用［17-18］，还参与诱导结肠Treg及产生IL-10的T细胞分化［8］。烟酸属于维生素B家族，参与人体的脂质代谢、氧化和无氧分解过程，在抑制炎症和动脉粥样硬化疾病的发生发展中发挥重要功能［19］。肠道共生菌群可以产生烟酸，Singh等［8］证实，烟酸可以通过GPR109a参与结肠Treg稳态的维持。小肠作为食物耐受诱导主要部位，对小肠RORγt+Treg分化发育的研究具有重要意义，为了进一步探索烟酸对RORγt+Treg分化发育的影响，本研究使用抗生素清除肠道共生菌群，使用流式细胞术检测小肠固有层RORγt+Treg亚群的比例及增殖情况，结果发现小肠固有层RORγt+Treg亚群比例及增殖出现显著降低。补充烟酸后，RORγt+Treg亚群比例及增殖均出现显著的恢复，因此作为共生菌群的代谢产物，烟酸在维持小肠固有层RORγt+Treg亚群的增殖中具有非常重要的作用。结肠中RORγt+Treg比例比小肠更高［4］，烟酸能否拯救因菌群紊乱导致的结肠RORγt+Treg比例的降低，目前还不清楚。Singh等［8］发现，烟酸能够拯救因抗生素清除肠道共生菌群导致Treg比例的降低，通过过继转移OTII CD4+T细胞，检测来自于供者的Treg也有相同的变化，提示结肠内RORγt+Treg的稳态可能也受到烟酸的调控。TH17是新发现的一种能够分泌白介素17的T细胞亚群，在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要意义。肠道分节丝状杆菌（segmented filamentous bacteria，SFB）调 控 肠 道TH17细胞的分化与发育，在促进免疫系统的成熟中起着非常重要的作用［20］，抗生素联合处理后由于SFB等诱导菌群的缺失，TH17比例显著降低，但是补充烟酸并不能恢复这一细胞的比例，因此烟酸可能不是SFB等细菌诱导TH17分化发育的因子。

细胞因子在T细胞发育过程中具有重要影响，细胞因子受体信号的转导激活STAT家族并介导疾病的发生，如促炎细胞因子IL-6与转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）就可以联合激活STAT3信号并增加RORγt的表达［3，15，21-22］，对于RORγt+Treg以及TH17发育发挥着重要的作用。在本研究中烟酸是否也可以通过STAT3信号调控RORγt+Treg的分化，目前还不清楚，共生菌群的缺失导致肠道pTreg细胞比例以及RORγt蛋白表达水平均显著降低［3，22］，在这一过程中STAT3信号可能具有十分重要的作用［22-23］，然而本研究发现，烟酸虽然能够通过调控RORγt+Treg的增殖来上调其比例，但是对RORγt蛋白的平均荧光强度并没有显著恢复作用，尽管菌群代谢产物短链脂肪酸可以通过STAT3以及c-Maf调控RORγt蛋白的表达水平［22］，但是目前还缺乏烟酸也可以通过STAT3调控RORγt蛋白表达的证据，另外STAT3的磷酸化是否参与烟酸促进RORγt+Treg的增殖过程，也需要进一步的研究。

综上所述，烟酸对于小肠RORγt+Treg亚群的稳态维持具有重要促进作用，本研究结果为预防及治疗食物过敏等疾病提供了理论基础，并有助于揭示肠道菌群维持口服耐受的机制。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突