精子DNA碎片化指数对其配偶体外受精-胚胎移植后胚胎质量的影响

杨光，李荣香

(漯河市中心医院 生殖医学与遗传中心，河南 漯河 462000)

精液常规分析是评价男性不育的重要参考指标，但无法全面反映精子的质量与功能[1]。精子可向胚胎提供50%遗传物质，其染色质结构是否正常对精子受精能力、胚胎发育及后期临床妊娠具有重要作用[2]。体外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET)对精子的质量要求较高[3]。精子DNA碎片(sperm DNA fragmentation，SDF)为精子形成期间受外界有害因素影响产生的一类产物，其含量在正常精子核遗传物中占比相对较小，可干扰男性生育能力[4]。精子DNA碎片指数(DNA fragmentation index，DFI)为近年临床评估男性生育能力的指标[5]，DFI含量越高，则男性生育能力越低[6]。本文分析DFI对其配偶IVF-ET后胚胎质量的影响，以期为临床早期干预提供可参考依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料选取2020年3月至2021年3月漯河市中心医院收治的139例行IVF-ET者为研究对象。男、女双方了解本研究内容并自愿签署知情同意书。依据DFI含量分为低含量组(DFI<10%，n=37)、中含量组(10%≤DFI<20%，n=76)、高含量组(DFI≥20%，n=26)。低含量组女27～39(33.15±2.72)岁，男27～40(33.67±2.87)岁；不孕时间2～6(3.97±0.79)a；获卵数8～13(10.33±1.12)枚；移植胚胎数1～3(1.71±0.35)枚；子宫内膜厚度8～13(10.32±0.97)mm。中含量组女27～39(33.09±2.85)岁，男27～41(34.01±3.12)岁；不孕时间2～6(4.10±0.84)a；获卵数7～13(10.02±1.09)枚；移植胚胎数1～3(1.62±0.29)枚；宫内膜厚度7～13(10.27±1.14)mm。高含量组女27～40(33.41±2.91)岁，男27～41(33.69±3.24)岁；不孕时间2～6(3.95±0.86)a；获卵数7～13(10.19±1.23)枚；移植胚胎数1～3(1.68±0.31)枚；子宫内膜厚度8～13(10.34±1.08)mm。3组女性年龄、男性年龄、不孕时间、获卵数、移植胚胎数、子宫内膜厚度等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，有可比性。本研究已通过医院医学伦理委员会审核。

1.2 选取标准(1)纳入标准：女方月经、子宫正常，具有输卵管原因不孕；男方输精管及外生殖器正常；夫妻双方为首次行IVF-ET术。(2)排除标准：男、女方染色体异常；女方具有子宫内膜异位症及子宫肌瘤等影响妊娠疾病；男方精液密度较低；男、女方存在认知障碍或精神障碍而无法配合；男、女方中任意一方伴有传染类疾病，如乙肝、艾滋病等；男、女方中任意一方伴有恶性肿瘤、肝肾功能严重异常；中途自愿退出。

1.3 研究方法

1.3.1精液收集、分析 男方禁欲2～7 d，经手淫方式取精，精液液化后进行观察和分析，结合计数的精液浓度，取一定量的精液稀释至100 μL，终浓度为(1～2)×106mL-1。

1.3.2精液处理方式 取卵当天精液处理方法是密度梯度离心联合上游法。精液处理试剂、胚胎培养试剂均购自SAGE公司。于取卵当天手淫取精，精液在37 ℃培养箱内液化后，于镜下观察并记录精液量、性质与精子功能等，分别取80%梯度试剂、40%梯度试剂各1.5 mL，加入15 mL离心管中使其产生两层清晰界面，再加1.5～3 mL液化精液，100 g离心20 min，沉淀混匀后100 g离心5 min，重复一次，取沉淀精子在培养箱内待用。

1.3.3IVF、胚胎观察和移植 于B超下经阴道穿刺取卵，卵母细胞的受精时间是绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)注射后39 h，于4 h后拆卵观察是否存在第二级体排出，次日晨起观察胚胎原核，同时进行原核评分(结合原核期核及核仁大小、数量、排列等分为Z1、Z2、Z3、Z4，Z1等级的囊胚形成率高)镜下看到原核确认受精。第3天胚胎观察分级，其中正常受精为原核观察时的2原核；细胞数超出7个，卵裂球为大小均匀是Ⅰ级胚胎，为优质胚胎。移植当天酌情选胚胎移植。

1.3.4精子DNA碎片化指数[7]取液化后新鲜精液，用0.1 mol·L-1PBS洗3遍，离心，再次混悬沉淀物，调精子浓度至5×107mL-1，涂片，待自然干燥；浸入Carnoy’s固定液(甲醇与冰醋酸以3∶1比例进行调配)2 h，待自然干燥；取新鲜配制的吖啶橙工作液浸染约5 min，流水轻柔冲洗，用蒸馏水封片，采用日本Olympus BX51型号荧光显微镜(×400)进行观察，每一视野观察时长不超出40 s。计数300个精子内红色精子与黄色精子的总百分比，即为精子DFI。注意精子计数均由同一医生进行。

1.4 观察指标(1)精液常规参数，即精子浓度、精子活力、前向运动精子数。(2)胚胎质量，包括优质胚胎率、种植成功率、受精成功率。(3)妊娠结果，包括临床妊娠率、流产率、活产率、早产率。

2 结果

2.1 精液常规参数3组精子活力、精子浓度对比，差异无统计学意义(P>0.05)。低含量组、中含量组前向运动精子数高于高含量组(P<0.05)。见表1。

表1 3组精液常规参数对比

2.2 胚胎质量低含量组受精成功率、种植成功率、优质胚胎率高于中含量组与高含量组，且中含量组受精成功率、种植成功率、优质胚胎率高于高含量组(P<0.05)。见表2。

表2 3组胚胎质量对比[n(%)]

2.3 妊娠结局3组流产率、早产率对比，差异无统计学意义(P>0.05)；低含量组临床妊娠率、活产率高于中含量组与高含量组，且中含量组临床妊娠率、活产率高于高含量组(P<0.05)。见表3。

表3 3组妊娠结局对比[n(%)]

3 讨论

受环境、饮食等多方面诱因影响，育龄期夫妇不孕不育发生率持续升高，而不孕不育的原因涉及男方与女方，其中男方因素包括器官及内分泌异常等，女方因素包括排卵异常、输卵管因素、免疫原因等。有关调查结果指出，全球15%育龄夫妇存在不孕不育问题，给自身与家庭带来一定困扰，甚至引起家庭矛盾[8]。临床针对不孕不育夫妻多主张使用辅助生殖技术进行受精，以IVF-ET干预为主，有助于提高妊娠成功率。随IVF-ET临床应用的增多，IVF-ET操作期间，存在部分精子和卵子接触但未受精，或胚胎移植之后因胚胎质量差而导致妊娠失败，在排除卵子问题和实验室操作问题之后，发现主要问题为精子质量，而精子的常规检测中并未发现显著异常问题，故认为与精子DNA的完整性相关[9]。精子DNA受损，可影响正常受精和受精卵的发育[10]。

精子DFI为近几年生殖医学界一项研究焦点，其可有效反映精子的DNA的完整性。引起精子DNA受损的主要机制如下：生精期间细胞凋亡；精子于运输期间受氧自由基的干扰；精子染色质包装存在异常[11]。精子DNA受损时，可干扰父源基因组完整性，干扰精子染色质组装、精子细胞异常凋亡以及氧化应激反应。本研究结果显示，随DFI指数下降，前向运动精子数、种植成功率、受精成功率、优质胚胎率、临床妊娠率、活产率逐渐升高。DFI指数>20%时，说明精子完整性存在缺失，致使精子与卵子细胞受精时受精率降低，或受精成功之后，胚胎发育不良而胚胎质量较差，极易出现流产等状况[12-13]。而本研究结果显示，3组流产率、早产率对比，差异无统计学意义，这可能与样本量小有关，可扩大样本量对本研究结果进一步论证。以往研究指出，精子DFI和精子核鱼精蛋白(P1、P2型)水平成反比，P1/P2下降时精子DAN损伤情况加重；鱼精蛋白含量减少、二硫键产生受阻为致使精子染色质的结构松散以及精子DNA完整性减少的主要原因，且P2缺少时，正常形态的精子率与精子活力明显降低[14-15]。本研究结果指出，3组精子活力对比，差异无统计学意义，精子DFI指数与精子活力无明显关联性，可能为本研究中纳入研究对象精力活力基本处于正常状况，而精子DNA完整性出现缺失的原因不包括精子细胞凋亡，故DFI存在差异，但精力活力无差异。

综上可知，IVF-ET后胚胎质量、妊娠结局受精子DFI指数影响，即精子DFI指数越高胚胎质量越差，因此临床可将精子DFI指数作为评估IVF-ET后胚胎质量、妊娠结局的指标之一，为临床中制定针对性改善妊娠结局的干预措施提供可参考依据。此外本研究仍具有一定不足，例如样本量选取相对较小，未来可扩大样本量，通过多中心研究获得更为可靠的研究结果。