新型冠状病毒肺炎患者差异表达先天免疫基因及其与24种免疫细胞丰度的关系

余耀华，张兵，张华

(郑州大学附属郑州中心医院 a.呼吸与危重症医学科一病区；b.泌尿外科，河南 郑州 450000)

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)引发了新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)的全球大流行，给人类生命健康和公共安全带来了巨大威胁[1-2]。先天免疫是抗病毒防御的第一道防线，SARS-CoV-2能够激活模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)触发下游级联信号分泌干扰素、肿瘤坏死因子和白细胞介素等细胞因子，而细胞因子进一步诱导抗病毒程序并增强适应性免疫反应[3]。在病毒感染持续刺激下，先天免疫和适应性免疫的过度激活，将导致大量炎症细胞因子分泌和T细胞反应失衡，引发“炎症风暴”，加重全身炎症反应[3-5]。研究表明，COVID-19更倾向于一种免疫相关疾病，感染者常伴有中性粒细胞和淋巴细胞减少，以及促炎基因和先天免疫基因的高表达[4,6-8]。然而，COVID-19患者先天免疫基因表达改变及其与免疫细胞丰度的关系仍不清楚。本研究采用生物信息学分析方法，利用GEO公共数据库中公开数据，探讨COVID-19患者外周血先天免疫基因表达改变及其与24种免疫细胞丰度的关系。

1 数据与方法

1.1 数据获取使用NCBI GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[9]，以“COVID-19”为关键词进行检索。筛选条件：(1)转录组测序数据集；(2)外周血样本；(3)样本来源的患者年龄、性别和人种信息完整。最终选择了基于Illumina NovaSeq 6000测序平台的GSE161731数据集，共包括198例外周血样本，本研究选取了其中77例COVID-19患者样本和19例健康对照样本纳入分析。

1.2 基因重注释和差异表达基因筛选下载GENCODE(https://www.gencodegenes.org/)[10]人类基因组GRCh38注释文件对GSE161731数据集原始测序数据进行重注释，并以校正后P<0.05及差异倍数[log2(fold change)，log2FC]绝对值>2为阈值，采用DESeq2包[11]筛选COVID-19患者和健康对照之间的差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)。

1.3 差异表达先天免疫基因筛选基于筛选出的DEGs，与InnateDB数据库(https://www.innatedb.ca/)[12]中的人类先天免疫基因集取交集，鉴别出差异表达的先天免疫基因(differentially expressed innate immunity genes，DEIIGs)。

1.4 DEIIGs功能富集分析基于筛选出的DEIIGs，采用Metascape(http://metascape.org)[13]在线分析平台，以P<0.01，富集因子>1.5，最小匹配count值>3为阈值，进行GO[14]和KEGG[15]功能富集分析。

1.5 外周血免疫细胞丰度估计采用ImmuCellAI(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/ImmuCellAI/)[16]平台预测24种免疫细胞丰度，包括CD4+T细胞，CD8+T细胞，幼稚CD4+T细胞，幼稚CD8+T细胞，中枢记忆性T细胞(central memory T cells，Tcm)，效应T细胞(effector memory T cells，Tem)，Ⅰ型调节性T细胞(type 1 regulatory T cells，Tr1)，诱导性调节性T细胞(inducible regulatory T cells，iTreg)，天然调节性T细胞(natural regulatory T cells，nTreg)，辅助性T细胞1(T helper 1 cells，Th1)，辅助性T细胞2(T helper 2 cells，Th2)，辅助性T细胞17(T helper 2 cells，Th17)，滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cells，Tfh)，细胞毒性T细胞(cytotoxic T cells，Tc)，黏膜相关恒定T细胞(mucosal-associated invariant T cells，MAIT)，耗竭性T细胞(exhausted T cells，Tex)，gamma delta T细胞(gamma delta T cells，γδT)和天然杀伤T细胞(natural killer T cells，NKT)共18个T细胞亚型，以及B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞6种重要免疫细胞。

1.6 统计处理及可视化采用R软件(4.0.2)进行基因重注释、统计学分析和可视化。组间比较采用独立样本t检验、χ2检验或H检验，相关性分析采用校正后的Spearman相关，采用ggplot2包绘制火山图，corrplot包和pheatmap包进行相关性分析可视化。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料COVID-19患者与健康对照年龄、种族差异有统计学意义(P<0.05)，性别差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 COVID-19患者与健康对照一般资料比较

2.2 基因重注释和DEGs表达共重新注释到55 586条基因，差异分析筛选出88个DEGs，包括 49个上调基因和39个下调基因。见图1。

A为DEGs火山图(Down为下调基因，Up为上调基因，Ns为无表达差异基因)；B为DEGs相对丰度热图。图1 COVID-19患者DEGs及其相对丰度

2.3 DEIIGs及其表达将人类先天免疫基因数据集的1 378个先天免疫基因与88个DEGs取交集，共鉴定出7个DEIIGs，包括UCHL1，IFI27，PPARG，CCL2，IGF1，BIRC5和IGHG1，其表达量在COVID-19患者中均上调。见图2A。

2.4 DEIIGs功能富集GO分析富集于STAT受体信号通路、淋巴细胞活化的正向调控和细胞因子介导的信号通路；KEGG分析富集于癌症代谢途径。见表2、图2B。

表2 COVID-19患者DEIIGs GO、KEGG功能富集分析

A为7个DEIIGs表达；B为7个DEIIGs GO、KEGG功能分析。图2 DEIIGs及其功能分析

2.5 24种外周血免疫细胞丰度改变COVID-19患者外周血幼稚CD4+T、Th1和Tcm细胞丰度降低，而Tr1和nTreg细胞丰度升高，差异有统计学意义(P<0.05)，其余免疫细胞差异均无统计学意义(P>0.05)。见图3。

注：*P<0.05；**P<0.01；ns为差异无统计学意义。图3 COVID-19患者外周血24种免疫细胞丰度改变

2.6 免疫细胞丰度改变与DEIIGs的关系外周血幼稚CD4+T细胞丰度与PPARG、IGHG1表达呈负相关，Tr1丰度与IGHG1表达呈正相关，nTreg丰度与BIRC5表达呈正相关，Th1与IFI27表达呈正相关，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注：*P<0.05；**P<0.01。图4 DEIIGs与免疫细胞的相关性

3 讨论

先天免疫在SARS-CoV-2感染中至关重要，干扰素作为先天免疫防御中抵抗病毒感染的重要细胞因子，主要经由Jak/STAT信号通路，诱导干扰素刺激基因的转录和抗病毒蛋白的表达，限制SARS-CoV-2复制并发挥抗病毒功能[17-18]。但与此同时，SARS-CoV-2也进化出多种机制逃避先天免疫感知，例如逃避PRRs感应和抑制干扰素信号传递，引发先天免疫反应不足或延迟，使得病毒在感染早期大量复制，导致过度激活的促炎反应并损伤组织器官[19-20]。SARS-CoV-2主要通过血管紧张素转换酶2受体进入靶细胞，由于其对先天免疫的逃避机制，机体通常无法短时间内清除病毒，而先天免疫细胞则进一步通过上调组织相容性复合体MHC Ⅱ 和免疫检查点分子表达来增强处理和呈递抗原的能力，形成抗原呈递细胞并激活适应性免疫程序，以此促进组织炎症、损伤修复和免疫消退[21-22]。

先天免疫和适应性免疫细胞均起源于骨髓的多能造血干细胞，有共同的生理发育基础，且在功能上相辅相成、互相促进，共同构成了机体牢固的免疫防御体系[23]。因此，我们假设SARS-CoV-2感染导致的先天免疫基因改变可能与免疫细胞丰度相关。本研究通过生物信息学分析，鉴别出COVID-19患者7个DEIIGs，基因功能主要富集于STAT受体信号通路、淋巴细胞活化的正向调控和细胞因子介导的信号通路3个生物学过程；同时，对免疫细胞丰度的估计结果显示，COVID-19患者外周血幼稚CD4+T细胞、Th1和Tcm丰度降低，而Tr1和nTreg丰度升高，一方面反映了外周免疫细胞的耗竭，另一方面也反映出了强烈的免疫抑制。这些结果与已报道的COVID-19患者干扰素水平下降、淋巴细胞减少以及促炎因子分泌增多的临床参数改变相关[19,24-27]，且与Huang等[28]的研究发现有一致性。而KEGG功能富集到了癌症信号通路，其中IFI27是COVID-19与癌症中被鉴别到的共性DEG[28-29]，表明SARS-CoV-2感染造成的免疫改变可能与癌症引起的免疫反应有一致性。此外，Liang等[30]研究结果也显示，相较于非癌症患者，癌症患者感染COVID-19的风险更高，且预后更差，暗示了COVID-19与癌症的内部联系，而这种关联可能来源于免疫改变。

研究表明，PPARG与抑制促炎反应有关[31]，而IGHG1的高表达能够促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭[32]。此外，BIRC5和IFI27也被发现在多种癌症中高表达，能够抑制凋亡并促进细胞增殖[33-34]，且与病毒感染有关[35-36]。本研究发现，PPARG、IGHG1表达与COVID-19患者外周血幼稚CD4+T细胞丰度呈负相关，可能参与了对幼稚CD4+T细胞的负向调控，抑制了幼稚CD4+T细胞的分化与增殖；而IGHG1、BIRC5和IFI27表达分别与Tr1、nTreg和Th1丰度呈正相关，可能与基因的正向调控有关，COVID-19引发的免疫紊乱导致了促炎与抗炎效应分子的“风暴”状态。然而，具体的分子调控机制和因果关系仍有待进一步探索和验证。

综上所述，本研究鉴别出了COVID-19患者中差异表达的7个先天免疫基因，探究了其参与的主要生物学过程和代谢途径，并揭示了先天免疫基因改变与免疫细胞丰度的关系，为进一步研究SARS-CoV-2感染引发的免疫分子机制提供生物信息学证据和实验方向。