肺泡灌洗液病原微生物宏基因组测序对儿童迁延性肺炎的诊断价值

谢向锌 黄伟萍 潘强 屈翔 劳金泉

儿童迁延性肺炎多由支气管肺炎迁延不愈演变而来，是以咳嗽、咳痰、气促、呼吸困难等肺炎症状及体征持续1至3个月为主要表现。病原尚未明确无法针对性治疗是病情迁延的重要原因。本院儿科在2019年6月至2021年6月对46例儿童迁延性肺炎患者，开展电子支气管镜检查，收集所有患儿的肺泡灌洗液进行病原微生物宏基因组二代测序（metagenomic next generation sequencing，mNGS），传统病原微生物灌洗液细菌培养等，并进行比较分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析2019年6月至2021年6月广西医科大学第四附属医院（柳州市工人医院）儿科住院患儿，符合儿童迁延性肺炎的诊断标准［1］患儿共46例，其中男24例，女22例；年龄最大11岁，最小2岁，（6.15±1.32）岁。（1）纳入标准：①符合儿童迁延性肺炎的诊断标准，经肺部X线或CT检查进一步明确诊断；②有电子支气管镜检查及肺泡灌洗适应证；③本次病程未进行病原学检查。（2）排除标准：①已明确诊断为哮喘、支气管扩张以及已有肺炎并发症的患儿；②严重肝、肾、心功能异常的患儿。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有家属均签署同意行电子支气管镜检查及肺泡洗液mNGS检测、传统的病原微生物学抗体检查及灌洗液细菌培养等相关操作与检测。

1.2 标本留取 所有患儿入院后行电子支气管镜检查，进行肺泡灌洗术，留取肺泡灌洗液10～20 mL分别进行病原微生物mNGS检测、传统的病原微生物学病原学培养［2］。肺泡灌洗液按《下呼吸道感染细菌培养操作指南》进行细菌培养分离，普通细菌培养采用血平板培养基、麦康凯培养基、巧克力培养基，真菌培养采用沙保罗培养基进行病原体分离培养。mNGS标本外送第三方基因检测公司（微远基因）作病原学检测，mNGS标本的采集、保存和运输过程严格按照该公司标准化规范执行。

1.3 观察指标 以检测出病原体为阳性，观察肺泡灌洗液病原微生物mNGS与传统的病原微生物检查方法所得病原菌的阳性率及差别，观察检测前抗菌药物的使用对两种检测方法结果阳性率的影响。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。应用四格表计算传统微生物培养和mNGS的灵敏性、特异性；病原学mNGS检测与传统病原学培养结果，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病原学检测结果 本次送检的46例标本中，通过mNGS检测出病原体41例，检测阳性率为89.1%，其中单一病原体感染34例：其中检出病毒4例，支原体2例，流感嗜血杆菌4例，副流感嗜血杆菌1例，铜绿假单胞菌2例，肺炎链球菌8例，屎肠球菌1例，大肠杆菌1例，曲霉菌2例，结核分枝杆菌1例，鲍曼不动杆菌3例，其他定植菌5例；混合感染7例：副流感嗜血杆菌+卡氏肺虫孢子1例，流感嗜血杆菌+病毒1例，鲍曼不动杆菌+肺炎链球菌1例，支原体+病毒1例等，阴性结果5例。采用传统肺泡灌洗液进行病原学培养，检测出阳性21例，阳性率为45.7%，其中病毒2例，支原体1例，流感嗜血杆菌4例，副流感嗜血杆菌1例，铜绿假单胞菌2例，肺炎链球菌6例，鲍曼不动杆菌1例，嗜麦芽窄食单胞菌1例，葡萄球菌属2例，肺炎支原体1例。

2.2 mNGS检测结果 传统病原学培养阳性的21病例中，mNGS结果均为阳性，传统病原学阴性的病例中，mNGS结果阳性为20例，mNGS结果阴性病例5例。以传统病原学检测结果为金标准，发现mNGS检测技术儿童迁延性肺炎病因的病原学诊断中的灵敏性为100%，特异性为20%，准确性为56.52%。

2.3 抗生素的使用对两种方法结果检出率的影响 46例患儿中有40例在检测前使用抗生素（检测前均使用抗生素超过3 d）。在40例检测前已经使用抗生素的病例中，mNGS检测的阳性率为87.5%，而传统检测方法的阳性率为47.5%，mNGS检测的阳性率明显高于传统方法，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

儿童迁延性肺炎多病因诊断较为重要，临床病原学常规方法有镜检、培养、抗原/抗体检测和核酸检测。依赖传统方法则部分感染性疾病病原体不能明确诊断，所以理想的病原学检测方法成为研究热点。二代测序技术（next generation sequencing，NGS）是相对于一代测序技术而言的新型测序方法。mNGS技术是指采用NGS技术对特定标本中所有核酸序列进行测序，它对病原学的诊断具有无偏移、全覆盖、高灵敏度、准确性高的特点，目前已经被广泛应用于临床各个领域，如用于快速检测各系统感染性疾病的病原微生物如脓毒血症［3-4］、中枢神经系统感染［5-7］、消化系统感染［8］、呼吸系统感染及爆发性感染［9］。与传统病原体培养相比，病原 mNGS 检测能敏感识别不同类病原体［10-12］，尤其在细菌感染合并真菌、病毒、支原体、衣原体等感染时更具显著意义。本研究结果显示，mNGS检测可使阳性率从传统培养的 45.7%（21/46）增高至89.1%（41/46）；与传统培养比较，mNGS技术可检测出的阳性病原体增加了9种细菌、2种真菌、4种病毒。以传统病原学检测结果为金标准，研究发现mNGS检测技术儿童迁延性肺炎病因的病原学诊断中的灵敏性为100%，准确性为56.52%，提示 mNGS 对病原体检测较传统培养敏感性更高，可以帮助感染患者明确诊断，细菌、病毒等感染患者可表现出相似的临床症状，针对病因进行正确干预，对指导抗感染的药物合理使用具有积极作用。本研究发现在检测前已使用抗菌药物的病例中，mNGS检测方法的阳性率较传统方法明显升高，提示mNGS检测方法检测结果受抗菌药物暴露的影响较小，有助于指导临床合理用药。

综上所述，肺泡灌洗液mNGS检测的结果受抗菌药物暴露的影响小，且在儿童迁延性肺炎病原检测敏感、诊断准确，可提高儿童迁延性肺炎的病原学诊断率，值得在临床推广。因此，对于儿童迁延性肺炎，病原体尚未明确，多次反复住院的患儿，或传统培养方法阴性且治疗效果不理想的，疑有特殊病原体感染的或者提示可能有传染性的感染等情况，为获得真实可靠的病原学资料，可选择电子支气管镜下对肺泡灌洗液进行mNGS检查，尽早完善病原学检查，选择合适的药物治疗，避免病情迁延，在感染性疾病病原学诊断中显示出巨大的临床应用价值，但仍存在一些问题，如它无法提供相应的药敏结果，且检测费用较高。故可根据临床需要，进行合理检查，以取得较好的治疗效果。