Kisspeptin-GPR54在哺乳动物妊娠中的研究进展

王 锋， 梅 山， 戴天姝， 魏士昊， 史远刚， 淡新刚*

(1.宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021； 2.六安市叶集区农业农村局，安徽 六安 237000)

KISS1基因首先在筛选抑制人黑素瘤细胞转移的基因中被发现[1].编码kisspeptin蛋白的KISS1基因位于人染色体lq32～41区域，由4个外显子和3个内含子组成，前2个外显子不翻译，第3个外显子由38个非编码碱基对构成，后接转录起始位点和其他103个编码碱基对，第4个外显子中包含332个编码碱基对、终止子和多腺苷酸化信号[2].KISS1编码的初始肽类产物由145个氨基酸构成，根据其水解后氨基酸链长度的不同可分为kisspeptin 54,kisspeptin14,kisspeptin13,kisspeptin10，统称为kisspeptins[3].kisspeptins家族及其包含的各级短肽，都具有相同 C 端结构Arg-Phe-NH2，属于RF-酰胺化修饰结构，具有相类似的生物学活性.目前已经克隆出很多动物KISS1基因的cDNA序列(包括人、牛、羊、猴、小鼠、大鼠和黑猩猩).通过氨基酸序列相似性分析，发现灵长类动物的相似性高于85%，而人和啮齿类动物之间有部分同源性(45%～50%)[4].研究发现，在人及鼠的大脑中,kisspeptin是G蛋白偶联受体54(G protein-coupled receptors 54，GPR54)的一个配体，kisspeptins作为其天然配体，发挥调控作用的途径就是通过激活其特异性受体GPR54来实现的[5].人类的GPR54基因含有5个外显子和4个内含子，位于19号染色体上，别名AXOR12或hoT7T175，其开放式阅读框架包括1 197个氨基酸，可编码相对分子质量为75 kD，其与甘丙肽以及阿片受体家族具部分同源性[6].Roa等研究发现,人类GPR54基因同哺乳动物序列相似性较高[7]，可达80%；但与水生动物或两栖动物有部分同源性(45%)，可见GPR54基因在不同动物中较保守，而kisspeptin及其受体GPR54基因在哺乳动物各个组织器官中大量表达，其生物学功能最初被界定为抑制肿瘤转移.突变或无法正常表达KISS1基因可能会引发子宫内膜癌、乳腺癌、膀胱癌等多种病症，还与多种恶性肿瘤的转移和侵袭有关[8].进一步研究发现，kisspeptin-GPR54系统在调节生殖活动中起关键神经元作用.kisspeptin神经元位于生殖轴的最上端，释放的kisspeptin与其受体GPR54结合后，调控促性腺激素释放激素的分泌，影响促卵泡素和促黄体激素的分泌，进而影响哺乳动物的各项繁殖能力，包括性别分化、青春期启动、促性腺激素分泌的调节以及激素和环境对生育的控制[9].除了在下丘脑-垂体-性腺轴起重要作用外，kisspeptin还参与动物机体代谢[10]、季节性发情[11]等一些列重要生理事件的调控.

研究表明，kisspeptin及受体在子宫和胎盘中高表达，缺乏kisspeptin信号刺激会影响胚胎与子宫的黏附和定位，kisspeptin对哺乳动物胚胎着床有重要作用；血清或血浆中kisspeptin水平异常与妊娠相关疾病关系密切，可能是诊断或预测妊娠相关疾病的潜在生物标记物.此外，血清或血浆中kisspeptin水平的检测也是妊娠早期流产诊断新的方法[12—13].因此，为明确kisspeptin-GPR54对哺乳动物妊娠的影响，笔者阐述kisspeptin-GPR54在胚胎着床、胎盘形成中的调控作用，归纳kisspeptin-GPR54在早期妊娠相关疾病诊断方面的研究，强调kisspeptin可能会成为新的妊娠早期流产诊断标志物，为进一步研究kisspeptin-GPR54在哺乳动物妊娠中的调控作用提供参考.了解kisspeptin-GPR54系统在妊娠过程中的表达、功能及其潜在的分子机制，有助于妊娠疾病的预防、诊断及治疗.

1 Kisspeptin调控胚胎着床

胚胎植入过程包括定位、黏附、穿透3个阶段.研究表明，kisspeptin-kiss1r信号可在人类和动物的子宫中表达.对于怀孕的小鼠，子宫中kisspeptin-kiss1r信号在胚胎植入中发挥重要作用[14].Francis等研究发现，在小鼠子宫内膜中，kisspeptin在妊娠第4天触发子宫中p38(mitogen-activated protein kinase p38)、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular reg-ulated kinase 1/2,ERK1/2)的磷酸化[15]，从而影响小鼠子宫内膜的形成及其功能.Zhang等研究发现[16]，当KISS1的表达被干扰RNA减弱时，基质细胞蜕膜化的进展被明显阻止.Babwah等的研究表明，kisspeptin能增加小鼠胚胎与I型胶原的黏附能力[17]，kiss1+/-的胚胎不能在kiss1-/-的子宫中植入，子宫中kisspeptin-kiss1r信号系统的缺失可能是囊胚无法与子宫上皮黏附的原因.此外，kisspeptin可能通过下调基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的活性，介导ERK1/2和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)信号通路增加小鼠囊胚对胶原的黏附[18].白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)是胚胎植入中非常重要的一种细胞因子.子宫腺来源的LIF是启动胚胎和子宫沟通的桥梁，使胚胎附着和基质细胞蜕膜.研究表明，kisspeptin可能是LIF的上游调节因子；kisspeptin调控胚胎植入过程的机制可能是通过上调LIF水平实现的[19].Mumtaz等研究发现,在接受卵胞浆内单精子注射的妇女血清中[20]，kisspeptin水平较低与植入失败有关，不明原因不孕的女性，血清中kisspeptin的缺乏与卵胞浆内单精子显微注射技术(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)植入的机会减少有关.Jamil等的研究发现[21],人绒毛膜促性腺激素给药当天血清中kisspeptin浓度升高是单精子注射后妊娠的一个积极预测因素，高水平的kisspeptin表达意味着胚胎植入成功率更高.综上所述，kisspeptin-kiss1r系统在胚胎植入中起重要作用，kisspeptin-kiss1r系统可能在囊胚和子宫内膜中发挥作用.通过下调MMP-2，MMP-9的活性，增加囊胚对胶原的黏附；上调LIF促进胚胎与子宫内膜的黏附来促进胚胎着床，且kisspeptin-kiss1r系统的缺失导致一部分胚胎植入失败[15, 22].

2 Kisspeptin调控胎盘的形成

胚胎植入后，滋养层干细胞立即增殖分化为绒毛和绒毛外2种细胞.非迁移性绒毛滋养层细胞融合形成位于绒毛外层的多核绒毛合体滋养层细胞，绒毛外滋养层细胞最终分化为胎盘床和血管内滋养层细胞.早期的研究表明，kisspeptin-kiss1r系统在胎盘的表达具有时空性，在调节胎盘功能方面可能起着基础性的作用[1, 23].Janneau等在早期通过RT-PCR证实，KISS1和KISS1r基因在人胎盘中可表达[24].人在早孕期间，KISS1基因主要在非迁移性绒毛滋养层细胞中表达，不在绒毛外滋养层细胞中表达[24—25].Bilban等研究发现[25]，kisspeptin-10增加早期胎盘滋养层细胞内Ca2+的浓度，以剂量依赖的方式降低胶原酶活性和MMP-2活性，使滋养层细胞迁移的能力减弱.Francis等的研究证实[15]，kisspeptin-10通过诱导ERK1/2磷酸化抑制了原代滋养层细胞MMP-1，MMP-13，MMP-17，MMP-19，MMP-110和MMP-114以及血管内皮生长因子的表达，降低滋养层细胞的迁移能力.除了调节MMP和血管内皮生长因子的表达和功能外，kisspeptin还以剂量依赖的方式，通过诱导ERK1/2与蛋白激酶C级联反应，迅速增加绒毛外滋养层细胞与I型胶原的黏附，降低滋养层细胞的迁移能力[18].

在来源于妊娠早期胚胎干细胞的人胎盘细胞系人绒毛膜滋养层细胞(HTR8)中，KISS1和KISS1r基因的mRNA和蛋白表达水平都显著低于原代滋养层细胞[26].Roseweir等研究发现[19]，kisspeptin-10通过激活ERK1/2-p90rsk-GSK3β-FAK信号通路抑制HTR8的迁移.另外，kisspeptin-kiss1r系统对牛胎盘子叶细胞系的细胞增殖具有负面调节作用，但在人类滋养层细胞中没有发现[26].上述研究表明，kisspeptin-kiss1r系统在人类胎盘形成中起重要调控作用，kisspeptin抑制滋养层细胞的侵袭和迁移，这与kisspeptin在抑制恶性黑色素瘤细胞转移潜能中的作用一致[1].Kisspeptin-kiss1r信号可能通过激活ERK1/2、抑制MMP的表达和活性，抑制滋养层细胞和绒毛外滋养层细胞的迁移，负向调节胎盘的形成.

3 Kisspeptin与早期妊娠相关疾病

3.1 Kisspeptin与异位妊娠

异位妊娠(ectopic pregnancy, EP)是指因生殖系统疾病或损伤等原因导致受精卵在子宫腔外着床，通常也称为宫外孕.异位妊娠的发病率为2%～3%，是早期妊娠孕妇死亡的主要原因.目前，EP的诊断主要基于经阴道超声检查和连续测定人绒毛膜促性腺激素β亚单位(β-hCG).但对于可能出现假阳性或阴性诊断的怀孕，诊断的准确性较低.因此，为提高EP诊断的准确性，研究一种新的诊断EP的生物标记物是必要的.kisspeptin可以促进胚胎黏附，在子宫内膜适当的位置着床.Gaytan等发现，在输卵管高表达的KISS1基因可防止大鼠异位着床[27].许多与异常胎盘有关的妊娠状况都与kisspeptin水平的异常变化有关.Romero Ruiz等的研究表明，在EP的前3个月[28]，kisspeptin水平显著下降；EP 中观察到的miR-324-3p表达增加，可能导致EP中KISS1基因表达水平的降低.KISS1基因表达的下降影响滋养层细胞侵袭过程，但这一过程有可能被局部产生的kisspeptin抑制，从而促进胚胎异位着床[25].综上所述，kisspeptin的表达水平在EP中受到抑制，进一步分析kisspeptin0、单独测定或与人绒毛膜促性腺激素(hCG)联合测定可能是一种新的EP鉴定方法.与传统方法相比，该方法可提高EP检测的灵敏度和特异性，为预防EP提供可靠依据.

3.2 Kisspeptin与子痫前期

子痫前期(preeclampsia, PE)是一种妊娠并发症，其特征是妊娠20周后并发高血压和终末器官功能障碍，是产妇死亡的第二大原因.Ziyaraa等的研究表明[29]，kisspeptin在预测和诊断子痫前期中发挥重要作用.对于PE诊断作用，PE患者在妊娠中期或晚期，血浆中kisspeptin水平明显低于血压正常孕妇的.PE患者血浆中kisspeptin水平与24 h尿蛋白定量呈负相关关系，与平均动脉压呈负相关关系，表明血浆中kisspeptin水平与病情严重程度相关[29].对于PE预测，妊娠11～14周或16～20周妇女的血清中kisspeptin水平，在随后发展为先兆子痫的妇女血清中显著降低，表明血清中kisspeptin水平的降低可能预示PE的发生[29].与此不同的是，Zhang等的研究表明[16]，KISS1基因在胎盘组织中的表达变化与PE患者的血浆或血清中kisspeptin水平不同，PE患者胎盘中KISS1基因的mRNA和蛋白表达水平明显高于正常妊娠妇女体内的.

胎盘中MMP-9的异常表达对胎盘的侵袭和成熟有负面影响，并与子痫前期的发生有关.研究发现，kisspeptin可下调胎盘中MMP-9的表达，局部KISS1基因的过表达可能引起胎盘的侵袭和成熟异常，是先兆子痫发生的基础[30].Stevens等的研究发现[31]，血管生成缺陷被认为与PE的发病机制有关，并与疾病的严重程度有关.研究表明，KISS1r基因已在血管平滑肌中被发现(包括主动脉、冠状动脉和脐静脉).Kisspeptin-10具有抗血管生成作用，并抑制胎盘动脉新血管生成[32].因此，kisspeptin可能通过与血管中的受体结合而对机体产生心血管效应，血浆中kisspeptin水平异常可能是促进PE发生的潜在因素[32].Dhillo等的研究表明[33]，服用kisspeptin与健康男女血压或心率的显著变化无关，表明局部产生的kisspeptin可能直接作用于胎盘组织，并在先兆子痫患者体中发挥抗血管生成的作用.最新的研究表明，PE患者血浆中的kisspeptin-10与β-hCG呈显著正相关，检测母体血浆中kisspeptin-10水平可能是一种有效筛查PE的方法，但目前的阳性预测价值较低，检测的灵敏度不高[34].

3.3 Kisspeptin与妊娠滋养细胞肿瘤

KISS1基因在胎盘中的高度表达，并在滋养层细胞侵袭调控中发挥重要作用[17].KISS1基因在胎盘局部表达的变化可能使胎盘侵袭性改变，并导致疾病的发生.妊娠滋养细胞肿瘤(gestational trophoblastic tumor,GTN)是一组恶性胎盘疾病，包括侵袭性葡萄胎、绒毛膜癌、胎盘部位滋养细胞肿瘤和上皮样滋养细胞肿瘤.一直以来，血清中hCG水平被用来预测恶性GTN化疗前、化疗中或化疗后的预后，但特异性不是很高[35].因此，研究一种生物标志物来诊断预测GTN 是有重要意义的.Janneau等的研究表明[24]，KISS1和KISS1r基因在葡萄胎(良性GTN细胞)中的表达显著增加，而在绒毛膜癌细胞(恶性GTN细胞)中的表达降低，表明KISS1基因在胎盘组织中的表达下调可能与其恶性程度有关.但在恶性GTN患者血浆中kisspeptins(包括kisspeptin-54，kisspeptin-14，kisspeptin-10)水平升高[36].在化疗期间和治疗后，GTN患者血浆中kisspeptin水平下降，表明血浆中kisspeptin水平可预测恶性GTN的预后[36].此外，恶性GTN患者在化疗前、化疗中、化疗后，血浆中kisspeptin水平与hCG水平均呈正相关关系，表明恶性GTN患者血浆中kisspeptin和hCG可能来源于同一组织，具有相似的分泌脉动[36].因此，单独检测血浆中kisspeptin水平或与hCG联合测定，对GTN的诊断和预测恶性GTN治疗具有重要意义.

3.4 Kisspeptin与子宫内膜异位症

子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)是指子宫内膜组织在子宫以外的部位出现、生长、浸润，反复出血，发生病变，继而引发疼痛、不孕及包块等[37].MMP-2，MMP-9属于基质金属蛋白酶家族，可降解细胞外基质及基底膜，可能有利于异位病灶的发展.研究发现，EMs的发生、进展与MMP活性增高有关[38].MMP-2，MMP-9的上调可能会促进细胞外基质蛋白的降解，促进细胞迁移和侵袭[38—39].Ziyaraa等的研究发现， kisspeptin抑制HT-1080细胞中MMP-9的转录[29].Bilban等的研究发现，kisspeptin可降低培养滋养层细胞中MMP-2的活性[25].同时，KISS1基因的表达也会因为MMP-2，MMP-9的切割而失活，这是一种负反馈机制[40].Abdelkareem等研究发现[41]，患有子宫内膜异位症的妇女，血浆中KISS1和KISS1r基因的水平降低；KISS1基因表达的减少可能会缓解对MMP-2，MMP-9的抑制，从而增加细胞外基质的降解.而子宫内膜异位症中MMP活性的增加降低了KISS1基因的表达，进一步减轻KISS1基因对迁移和侵袭的抑制作用[41].此外，异位内膜组织中KISS1基因持续低表达可能导致持续的组织浸润，造成深层浸润性子宫内膜异位和异位卵巢囊肿发生[41].综上所述，患有子宫内膜异位症妇女的子宫内膜间质中KISS1和KISS1r基因水平降低；在异位病变的类型中，KISS1基因水平在深层浸润性子宫内膜异位植入与浅层异位内膜植入中相比更低.KISS1基因持续低水平,在子宫内膜异位症的发生和发展预测中有重要作用.

4 Kisspeptin与早期流产

流产是早孕期间最常见的疾病.一直以来，血清中β-hCG定量检测被用作流产的生物标志物，但该方法诊断流产的准确性不高.研究发现，外周血中kisspeptin的浓度在怀孕前中期逐渐增加，在怀孕后期明显升高，且比未怀孕的妇女高7 000倍.与选择性终止妊娠的妇女相比，反复流产的妇女胎盘中kisspeptin的表达水平明显较低[42].研究发现，血浆或血清中kisspeptins(kisspeptin-10或kisspeptin-54)水平在区分和确认流产方面显示出与hCG同等甚至更高的准确性[12, 43].以6～10周的孕妇为研究对象[12]，在宫内妊娠妇女(20人)和确诊流产妇女(20人)血清中均检测到kisspeptin-54.以8～14周的孕妇为研究对象[12]，在单胎妊娠妇女(899人)和确诊流产妇女(50人)的血清样本中均检测到kisspeptin-54，kisspeptin-14和kisspeptin-10.这些结果证明，血浆中kisspeptin水平可作为妊娠早期流产的判断标准，且在预测结果上可能比传统hCG好.此外，与单独测定kisspeptin相比，kisspeptin和hCG联合检测显示出与单独检测相同的诊断准确率[12].因此，血清中kisspeptin和hCG水平在预测妊娠早期流产方面具有相似的诊断意义[12].

最新的研究发现，临床妊娠妇女的血清中kisspeptin水平高于生化妊娠丢失和未能受孕患者的.与已有研究不同的是，kisspeptin与β-hCG相比，在预测流产方面具有更多的诊断信息[44].Hu等评估了血清中kisspeptin水平在冻融胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transform,IVF-ET)后第14天和第21天的预测价值[45]，发现孕妇在胚胎移植后第21天血清中kisspeptin水平高于胚胎移植后14天的，胚胎移植后14天血清中kisspeptin水平与胚胎着床率呈负相关关系.综上所述，在不同的研究中，kisspeptin对妊娠流产的预测结果不同，可能的原因是，样品的采集方法、不同的处理时间和储存条件，但是血清中的kisspeptin水平仍可能是一种新的早期妊娠流产诊断标志物.

5 总结与展望

外周子宫和基于胎盘的kisspeptin-kiss1r系统是妊娠的主要调节因素.子宫系统调节胚胎植入和蜕膜化，而子宫系统和胎盘系统调节胎盘形成.子宫中kisspeptin-kiss1r系统通过控制子宫内膜腺体分泌物(如LIF)来调节胚胎着床，并以自分泌或旁分泌的方式抑制蜕膜细胞的运动，从而间接调节胚胎和胎盘对子宫的侵袭.胎盘中kisspeptin-kiss1r系统负向调节绒毛外滋养层细胞的迁移和侵袭，从而直接控制胎盘对子宫的侵袭.虽然kisspeptin-kiss1r系统在哺乳动物胚胎着床及胎盘形成过程中起重要作用，但具体的调控机制仍然不清楚，需进一步的研究.并且，kisspeptin与妊娠相关疾病的发生关系密切，外周血中kisspeptin已成为诊断这些疾病的潜在生物学标志物.目前，仍有许多问题待解决，如不同的样品采集方法、不同处理时间和储存条件会导致检测的kissspeptin浓度存在差异；kisspeptins在体内存在多种形式，究竟检测其中一种还是总的kisspeptins浓度，才能更准确诊断相关疾病；对于血中有效kisspeptins的检测方法仅限于放免试剂盒，缺乏其他有效诊断方法等.这些都需进一步深入研究，并建立标准化样本的采集、处理、检测方法.另外，在妊娠的第1个月，针对血清中kisspeptins浓度变化规律的研究较少，其浓度是否与妊娠发展呈正相关关系还不得而知.在妊娠前5周内，血清中kisspeptin浓度明显高于未妊娠体内的，且浓度变化与hCG类似，因此可发展成一种新的早孕诊断方法.此外，在脑中枢，kisspeptin神经纤维与产生催产素的神经纤维相接触，中枢kisspeptin注射能够刺激妊娠末期催产素的合成，表明kisspeptin可能参与调控分娩的启动[46].另外，研发新的动物模型，以促进我们对健康和疾病中kisspeptin-kiss1r信号的理解.在研究胎盘形成时，主要依赖小鼠和大鼠作为人类胎盘形成的实验室模型，而其他小型动物(如豚鼠)，可更好地概括在女性身上观察到的绒毛外滋养层侵袭和螺旋动脉重塑，因此，在豚鼠方面的实验可能是有关kisspeptin-kiss1r在女性妊娠研究中的重要补充.因此，进一步探索kisspeptin在不同种动物妊娠中的调控机制，不仅更好地了解kisspeptin-kiss1r系统在调节哺乳动物妊娠和动物繁殖中的作用，还可为妊娠相关疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法.