羊肚菌分类鉴定方法及人工栽培技术研究进展*

2022-11-22李峻志贺晓龙赵瑞华高小朋

中国食用菌 2022年3期

乔婷，李峻志，戴璐，贺晓龙，赵瑞华，高小朋**

（1.延安大学生命科学学院，陕西延安 716000；2.陕西省微生物研究所，陕西西安 710043）

羊肚菌（Morchella spp.）是一种珍稀的食药兼用真菌，隶属于子囊菌门（Asomycota）盘菌纲（Pezizomycetes）盘菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchellaceae），其风味独特，富含多种活性物质，在世界范围内具有很高的科学价值和经济价值[1]。据报道，羊肚菌的栽培是近100多年来的研究热点，很早以前就有过关于食用野生羊肚菌的相关记录，随着其营养价值逐渐被发现，研究人员开始深入研究羊肚菌的生态分布特征、系统发育关系、人工栽培技术以及食（药）用功效等[2-3]。但是对于羊肚菌分类鉴定方法和科学的人工栽培技术研究一直都备受争议。因此，通过对目前羊肚菌的分类鉴定方法及人工栽培技术（主要包括菌种和外源营养两大难题）进行综述，以期为羊肚菌的优良种质资源开发和人工栽培技术研究提供科学思路，为产业的良性健康发展奠定扎实的理论基础。

1 羊肚菌分类鉴定方法

1.1 形态分类鉴定

早期研究主要是依据宏观和微观形态特征对羊肚菌属进行分类。宏观特征主要包括菌盖、菌柄、子囊果的形状、大小、颜色，菌盖与菌柄交界处的特征，脊和凹坑的排列、形态、颜色等；微观方面主要包括子囊的形状、分布特征，子囊孢子和侧丝的形状、直径、颜色，刚毛的形态、大小，菌盖上是否有绒毛、菌柄上是否有颗粒附着物以及其形态和大小等。此外，羊肚菌不同时期菌丝的形态特征、孢子印颜色、菌核的形态、形成时间以及在培养基上的分布特征等，都可以辅助进行羊肚菌的形态学分类[4]。在英国真菌索引数据库（Index Fungorum）中，羊肚菌属记录有350个名称物种，去除同物异名的情况，全球可能有近150个形态学物种[5]。根据羊肚菌菌盖颜色、棱纹走向、菌盖凹陷深浅及形状、菌盖边缘是否明显向外伸展、菌盖近中部与菌柄是否分离等特征，将羊肚菌分为黑色羊肚菌类、黄色羊肚菌类及半开羊肚菌类共3个形态分类单元[6-9]。根据成熟时子囊果的子实层和菌柄变红与否提出了第四个类群，即变红羊肚菌类群[10]。最新研究证明，使用复水、脱水、临界点干燥制备技术对羊肚菌子囊孢子进行扫描电子显微镜（SEM）成像，可以提高孢子壁表面的分辨率，从而增加形态学特征的数量[11]。羊肚菌表型特征往往与地理发生或生态学相辅相成，特别是与特定乔木或灌木的假定关系，有时也可以提供形态分类信息[12]。但可用于羊肚菌属物种形态学分类的特征较少，且同一物种内形态学特征差异较大，形状、颜色和大小又会随着环境、地理位置的变化发生改变，甚至在不同生长阶段都存在较大差异，因此造成羊肚菌同物异名和同名异物的现象频出[13-14]。

1.2 系统发育学分子鉴定

系统发育学分子鉴定是以DNA序列为特征，通过测定一个或者几个标准的目的基因，如真菌中的ITS、LSU等DNA序列，来进行物种多样性分析以构建正确的物种鉴定体系[4]。截止2010年，羊肚菌属的分子系统标记以核糖体DNA的内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）为主；之后，随着分子生物学技术的发展，多基因联合分析技术形成，可通过多个基因的核苷酸序列构建系统发育树，比较其拓扑学关系，并以此界定物种[15]，截至目前，该方法一直是羊肚菌分类研究的主要方法。

1.2.1 单基因测序

在过去很长一段时间中，ITS被用作分析环境样本中真菌多样性的靶标，ITS序列分析技术广泛用于真菌的分子鉴定和系统发育分析，但基因库（Gen－Bank）中ITS数据来源广泛，其命名的准确性直接影响基于ITS序列分析的鉴定结果[16]。此外，有学者通过研究国际序列数据库，估计了真菌界目前可获得的所有真菌种内ITS变异性；在数据库内部发现了巨大的差异，其结果难以将分类单元的分类隶属关系或营养模式相关联；而对于种内变异，似乎没有一个统一而严格的上限适用于整个真菌界，例如典型的3%阈值。因此，不应使用简化的方法来实现基于ITS的物种界定[17]。

1.2.2 多基因联合测序

鉴于此，研究人员在ITS序列分析的基础上，通过增加LSU、rpb1、rpb2和tef1多个基因的DNA序列来界定物种，使分类与鉴定结果更加科学和客观[18]。研究结果证实，如使用单一的ITS序列鉴定羊肚菌属物种，仅有约76%的系统发育学物种可以被识别；而利用4基因进行联合分析（ITS+tef1+rpb1+rpb2），则可以鉴定出该属的所有物种[19-20]。在此研究基础上，研究人员提出羊肚菌属由黄色羊肚菌支系（Esculenta Clade）、黑色羊肚菌支系（Elata Clade）和变红羊肚菌支系（Rufobrunnea Clade）构成[21]，这一结论较形态学分类更加准确。随着羊肚菌分类研究的深入，羊肚菌多基因序列模标数据库（Morchella Multilocus Sequence Typing，Morchella MLST）[20]应运而生，这一数据库的建立为研究人员更加准确地鉴定羊肚菌提供了便利。截止目前，该数据库包含了分别为ITS、LSU、rpb1、rpb2和tef1等5个片段的2 406条羊肚菌基因序列，其中羊肚菌研究专家提供了2 160条序列，另外246条序列来源于GenBank且已被证明其准确无误。相关学者可以通过该数据库获得羊肚菌序列数据、相应的物种名称及馆藏标本或培养物等信息，同时也可以向该网站提供有关羊肚菌的可靠的DNA序列数据[22]。

2 人工栽培研究进展

2.1 人工栽培的关键影响因素

目前，影响羊肚菌人工栽培成功与否的因素较多，主要包括栽培品种的选择、栽培季节的安排、制种技术、播种技术、营养袋技术、环境调控技术等，但菌种技术和外源营养补料技术仍然是影响我国羊肚菌产业化快速发展的两项关键因素[23-24]。

2.1.1 菌种

菌种几乎是所有食用菌栽培的关键，菌种的质量差异直接影响着栽培的成功与否。而羊肚菌是一种生活史较为复杂的子囊菌，从初期子囊孢子萌发成菌丝体，菌丝生长后期通过紧密连接交织形成休眠体结构“菌核”，到最终形成子囊果从而又产生分生孢子，其机制可能与遗传背景、发育和环境条件等密切相关。且由于羊肚菌的菌核没有明显的菌核结构特征，又被称为“假菌核”。研究表明，羊肚菌菌核的形成情况与菌种的活力、纯度、培养条件以及培养基配方等密切相关[25-26]。最新研究检测出只有一种交配型基因存在于羊肚菌菌核中，因此可考虑将其作为选育菌种的材料，但菌核与羊肚菌子实体的形成以及产量之间的关系有待进一步研究[27]。此外，羊肚菌栽培过程中会产生大量的分生孢子，最新研究成果表明，羊肚菌分生孢子由营养菌丝产生，部分分生孢子包含1个～3个核；结合相关研究成果推测，分生孢子可能通过3种途径参与羊肚菌子实体的形成过程，极有可能是作为精子细胞提供相反的交配型基因，也可能萌发成雌雄同体的兼性菌丝体，或作为生殖繁殖体参与其生殖过程；但羊肚菌分生孢子的发生与子实体形成以及是否为栽培中必不可少的阶段仍旧没有定论[28-29]。由于目前对羊肚菌复杂的生物学基础研究较少，严重制约了羊肚菌野生品种驯化以及新品种选育的进度。因此，目前人工栽培的羊肚菌品种仍然集中在黑色类群中，包括梯棱羊肚菌（M.importuna）、六妹羊肚菌（M.sextelata）、七妹羊肚菌（M.exima）、头丝羊肚菌（M.exuberans）、欧氏羊肚菌（M.owneri）、Mel-13和Mel-21在内的7个系统发育种，其中以六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌栽培规模最大[30]。而其他品种的羊肚菌是否可以进行人工栽培尚不清楚，有待进一步研究[31]。

系统科学的羊肚菌菌种质量评价体系对产业的发展必不可少，但羊肚菌菌丝体的形态特征随着培养基的变化表现出不稳定性，这无形中提高了菌种质量评价的难度[32-33]。因此，我国尚无明确的羊肚菌菌种质量标准，大部分菇农仅根据菌核数量来判断羊肚菌菌种质量。最新研究表明，通过对羊肚菌菌株分类地位、交配型基因、菌株活力综合评估，可确保菌株在人工栽培过程中表现出优良、稳定的性状[34]。另一方面，菌种老化是羊肚菌栽培过程中的普遍现象。研究发现羊肚菌菌种老化与频繁地传代培养、不当的培养和保存条件、或营养环境不匹配相关[35]；也有研究表明羊肚菌菌种老化机制与线粒体活性相关，但对于指导生产来说还是缺乏系统的研究[36]。目前生产者对于此问题的解决办法是反复从孢子培养物中重新选择菌种，但依然难以保证菌种的稳定性[37]。基于此，研究人员只有通过选育多个性状优良、产量稳定、可人工栽培的品种，同时深入研究羊肚菌菌种老化以及菌种与子实体形成之间的内在机制，才能加快羊肚菌人工栽培技术的发展。

2.1.2 外源营养

外源营养袋技术的发展，较好地解决了羊肚菌人工栽培过程中营养补给这一难题，我国研究人员经过数十年的科研和实践，使该技术日趋成熟。但在外源营养袋的使用过程中，菇农们对于营养袋的科学配比、制作技术、放置时间、数量以及撤袋时间等仍众说纷纭，因此营养袋作用机制的研究尤为重要[24，38]。

外源营养袋技术是羊肚菌栽培过程中的关键环节，只有准确地掌握其制作和使用的技术要点，才能提高出菇的质量和产量。研究发现，外源营养袋的配比与羊肚菌的出菇周期、产量呈正相关性，如按照小麦58%、阔叶树木屑30%、腐质土10%、石膏1%、石灰1%的配比，既有利于缩短梯棱羊肚菌的出菇周期，也可以提高产量；放置外源营养袋时，采用“一”字形状的划口，有利于降低污染率、提高产量[39]。研究人员通过检测并分析了7种常见食用菌栽培原料的化学成分，结合栽培试验验证，探究了羊肚菌栽培产量背后的营养袋化学成分差异效应，为现有的营养袋配方提供了理论支撑[40]。另外，通过研究营养袋相关因素对羊肚菌生长的影响，发现施放营养袋时间与出菇期呈正比，营养袋中麦粒含量与子实体产量也呈正比[41]。也有研究发现，外源营养袋的重量变化量和子实体产量成正相关；当外源营养袋重量减轻＞50%，羊肚菌产量才可以达到正常产量（2 250 kg·hm-2）以上[42]。

有研究通过使用放射性标记发现，在羊肚菌营养生长过程中，从营养丰富到营养贫乏环境的改变，可以诱导真菌进入生殖生长周期，在此周期中形成子囊果[43-46]。为了研究羊肚菌的营养转运机制，Amir等[47]用细胞压力探针测定了分割平板培养羊肚菌时菌丝和菌核中膨压的变化；对于包括羊肚菌在内的形成菌核的真菌，菌丝的生长、菌核的形成和发育过程中，存在着菌丝和菌核的变化以及两者之间物质的转运；影响物质转运的因素包括培养基的水势梯度和菌丝、菌核的代谢活性及其膨压差[48]。为了研究羊肚菌的分解及营养运输机制，研究人员对一株可人工栽培的羊肚菌进行了基因组测序，并鉴定了营养袋分解装置的编码基因；然后用转录组学和宏蛋白质组学结合生物化学技术，分析编码后碳水化合物活性酶（CAZymes）的表达情况；结果表明，羊肚菌营养菌丝体定植于外源营养袋上，释放出一系列降解酶，有效分解和代谢多糖，如小麦和稻壳中的淀粉和纤维素；经此分解机制释放的代谢产物运输到菌床附近的土壤表层，进而诱发子实体形成；该发现有助于更详细地描述诱发羊肚菌子实体形成的分子机制[49]。

2.2 栽培模式

2.2.1 大田栽培模式

随着羊肚菌人工栽培技术的日益成熟，我国在田间和林下栽培羊肚菌的规模迅速扩大。其中大田栽培主要包括田地的选择与整理、菌种制备、播种、补料技术、保育催菇、出菇管理和采收干制等主要环节。为了降低生产成本，合理利用林木资源和土地空间，学者和菇农也尝试通过模拟自然环境林下栽培羊肚菌，并经研究发现，羊肚菌林下设施栽培中，在栽培床上方采取“搭建小弓棚+覆盖薄膜”的方式，比单纯覆盖遮阳网的方式产量更高[50]。

2.2.2 设施化栽培模式

由于羊肚菌大田露天栽培易受气候和土壤的强烈影响，风险较大；如2021年气候反常，全国冬季平均气温集中在4℃～12℃，导致多地出菇过早，羊肚菌的营养生长还未达到生理成熟，同时由于温差变化较大，发生大面积死菇，给羊肚菌栽培者造成巨大损失[51]。随着产业大规模发展，为了减少自然气候条件对羊肚菌栽培造成的影响，近几年越来越多的从业者开始摸索适宜当地气候条件的设施化栽培模式。所谓设施化栽培，主要是通过机械设备干预，采用工程技术手段，创建适宜羊肚菌生长的气候条件。根据地域差异，目前羊肚菌设施栽培主要以“南方冷棚、北方暖棚”2种模式为代表[52]。

1）南方冷棚

南方地区的冷棚以简易的塑料大棚为代表，用镀锌钢架为主要材料，棚顶覆盖塑料薄膜。冷棚搭建成本低、速度快、使用方便[53]。但冷棚栽培羊肚菌的周期较长，一般需要经过5个月～6个月的管理，才可以出菇。

2）北方暖棚

为了抵御恶劣气候环境的影响，北方暖棚多为半拱形，呈坐北朝南建设[54]。暖棚羊肚菌栽培一般从11月上旬开始播种，经过菌丝着床萌发、地表菌霜形成、菌霜消失，共计需要50 d～60 d，次年元旦前后进行出菇管理，栽培周期相对较短[55]。

2.2.3 工厂化栽培

虽然以上2种模式从某种程度上可以保证羊肚菌人工栽培的成功率，但无法实现羊肚菌的周年化栽培，因此研究人员在室内工厂化栽培方面不断地探索，并取得一定成效。

美国Garry Mill早在1982年就进行了羊肚菌工厂化栽培的研究，并于2005年获得成功，使整个栽培周期只需要70 d[38]，这是世界上迄今为止唯一实现羊肚菌工厂化栽培的典型。而在我国食用菌产业快速工业化发展的大趋势下，羊肚菌的室内栽培技术也成为了当下研究的重点。研究表明，目前记录的羊肚菌大部分属于低温型菌类；在菌丝营养生长阶段，需控制生产车间温度在15℃～18℃，培养基质含水量为70%～80%；生殖生长阶段，子实体最适宜的温度为13℃～16℃，空气相对湿度保持在85%～95%，光照为 400 lx～500 lx，CO2浓度＜0.3%[38]。根据最近报道，中国科学院昆明植物研究所珍稀食用菌研究团队于2021年2月，成功研发出羊肚菌工厂化栽培成套新技术，初步实现了工厂化栽培羊肚菌[56]。