复合微生物菌剂对番茄青枯病的生防效应

王文丽,金涵,从炳成,周蕾,韦中,王世梅

(南京农业大学资源与环境科学学院/江苏省固体有机废弃物资源化研究重点实验室/江苏省有机固体废弃物 协同创新中心/教育部资源节约型肥料工程技术研究中心,江苏 南京 210095)

番茄是世界上重要的蔬菜作物,全球年产量约1.6亿t,由青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的青枯病,对番茄的破坏性高,常导致番茄植株的大面积枯萎死亡,造成巨大的经济损失[1]。因病原菌的遗传多样性、耐药性及广泛的宿主范围,用化学杀菌剂防治的成功率不高。当前市场上能防治青枯病的化学药剂极少,登记的仅有噻森铜,且化学杀菌剂的长期使用也会对人类健康和环境造成许多不利影响[2-3]。近年来,利用有益功能微生物防控青枯病已成为一种安全、可靠的防控方法。功能微生物包括无致病力的劳尔氏菌、青枯菌噬菌体及拮抗生防菌株[4]。研究表明,无致病力的劳尔氏菌通过与青枯菌竞争生态位而抑制病害发生,但其在田间环境中难以在根际大量定殖,导致与致病菌的竞争力相对较弱[5]。青枯菌噬菌体能够靶向控制病原菌,在防控番茄青枯病中亦有应用[6],但噬菌体施入土壤后常面临着扩散率低、失活率高等问题,且病原菌分泌的胞外多糖也会限制噬菌体的吸附,从而影响其应用效果[7]。拮抗生防菌主要包括芽胞杆菌、链霉菌、木霉等,这些生防菌株能够通过产生拮抗物质、与病原菌竞争营养及诱导植株产生系统抗性等方式抑制青枯菌生长,从而降低植物发病率[8]。生防菌株因其在根际定殖后能够自行传播与维持,起到长期抑制土传病害的作用,能减少非再生资源的投入[9],因此在农业生产中得到广泛应用。链霉菌(Streptomyces)是土壤放线菌中的重要类群,约占土壤可培养微生物的20%,普遍存在于根际土壤中,可以产生多样的次生代谢产物帮助植物抵御病原菌的入侵[10]。链霉菌在固体发酵基质上可形成丰富的分生孢子,易于储存和运输。芽胞杆菌(Bacillus)营养要求简单,产生的芽孢抗逆性强,兼具拮抗及促生作用[11],是生防菌筛选的重要对象。单一生防菌剂的应用效果常不稳定或持续时间较短,研究不同功能微生物之间潜在的协同效应,探索施用复合微生物制剂控制植物病害是克服单一菌剂缺陷的途径之一。本研究以筛选的拮抗放线菌与芽胞杆菌为材料,研究复合菌剂防控番茄青枯病的生防效应,为土传病害的防控提供生防策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株拮抗放线菌WL-3、WL-4;细菌XL-2、CW-02;青枯劳尔氏菌(R.solanacearum)1115,均由本实验室分离、保存。

1.1.2 培养基高氏1号培养基:可溶性淀粉20.0 g,KNO31.0 g,NaCl 0.5 g,K2HPO40.5 g,MgSO40.5 g,FeSO40.01 g,去离子水1 000 mL,pH7.5。燕麦培养基:燕麦片20.0 g,MgSO40.2 g,KNO30.2 g,K2HPO40.5 g,琼脂粉20.0 g,去离子水1 000 mL,pH7.5。牛肉膏蛋白胨培养基(NA):葡萄糖10.0 g,蛋白胨5.0 g,酵母粉0.5 g,牛肉膏3.0 g,去离子水1 000 mL,pH7.5。铬天青(CAS)检测培养基:CAS 0.060 5 g,十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)0.072 9 g,1 mmol·L-1FeCl310 mL,0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液50 mL,去离子水 940 mL,琼脂9 g。L-色氨酸培养基:甘露醇10.0 g,K2HPO40.5 g,MgSO40.2 g,NaCl 0.1 g,酵母膏1.0 g,NH4NO31.0 g,L-色氨酸0.1 g,去离子水1 000 mL,pH7.0。吲哚乙酸(IAA)比色液:0.5 mol·L-1FeCl31 mL,硫酸30 mL,去离子水50 mL。种子发酵培养基:葡萄糖45.0 g,黄豆粉30.0 g,CaCO35.0 g,酵母粉5.0 g,去离子水1 000 mL,pH7.5。

1.2 拮抗放线菌及拮抗细菌的初步鉴定

根据《放线菌快速鉴定与系统分类》[12]和《链霉菌鉴定手册》[13]的方法,对前期从南京郊区番茄大棚土样中筛选获得的具有拮抗番茄青枯菌能力的放线菌菌株WL-3、WL-4及细菌菌株CW-02、XL-2进行初步鉴定,检测其形态及理化特征。提取菌株的总DNA,采用细菌16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增,并进行基因序列分析,所得序列与NCBI数据库中已知序列进行比对和同源性分析,用MEGA 7.0的Neighbor-joining法构建系统发育树,确定菌株的分类地位。

镜检观察菌株CW-02、XL-2细胞形态、有无芽孢及芽孢着生的位置,并测序分析16S rRNA基因序列,确定其分类地位。

1.3 拮抗放线菌菌株对青枯菌分泌胞外多糖的影响

将放线菌菌株的斜面孢子(2～3环)接种在50 mL高氏1号液体培养基中(250 mL三角瓶),于180 r·min-1摇床28 ℃发酵96 h,8 000 r·min-1离心15 min,取上清液。于30 mL NA液体培养基接种 200 μL 108CFU·mL-1青枯菌,再根据预试验的结果,添加5 mL上述上清液,与青枯菌共培养24 h。取样,透射电镜下观察菌体形态并拍照。

1.4 芽胞杆菌的生物学特性

1.4.1 芽胞杆菌产铁载体及IAA的定性检测将待测菌株接种于CAS培养基上,于28 ℃培养5 d,如果菌落周围出现有橘黄色透明圈,表明待测菌株产铁载体。将待测菌株接种于装有25 mLL-色氨酸液体培养基的50 mL的离心管中,28 ℃、125 r·min-1振荡培养5 d,取样,离心取上清液,在2.5 mL离心管分别加入200 μL IAA比色液和上清液,静置15 min后观察。如果显现红色,则为阳性,说明菌株分泌IAA,并且显色越深表明菌株分泌IAA的能力越强。

1.4.2 H2O2耐受性及SOD活性测定将菌株CW-02、XL-2的菌体细胞分别接种NA液体培养基,180 r·min-1培养12 h后,分别添加NA液体培养基体积的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5% H2O2,2 h后吸取 100 μL 于平板涂布计数,每个浓度设3个重复。测定菌株产SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法,酶试剂盒购自南京建成生物有限公司。

1.5 拮抗放线菌与芽胞杆菌菌株间的相容性检测

利用平板交叉划线法检测菌株间的相容性。分别用接种环蘸取新鲜的放线菌分生孢子及芽胞杆菌菌苔,于PDA平板上交叉划线,28 ℃培养5～7 d后,观察各菌株在交叉划线接触点的生长状况。

1.6 放线菌及芽胞杆菌的固体发酵

1.6.1 放线菌的固体发酵于250 mL锥形瓶装入30 mL种子发酵培养基,灭菌后,分别接种菌株WL-3、WL-4新鲜的孢子悬液,28 ℃、180 r·min-1条件下培养48～60 h,获得液体种子悬液,然后接入固体发酵基质。

取固体发酵基质40 g,混匀装入500 mL锥形瓶,121 ℃灭菌30 min,接种10%种子悬液。48 h摇动 1次,观察基质颜色及气味的变化,28 ℃发酵14 d后,取样测定孢子数。具体方法:称取10 g菌剂,添加 90 mL 无菌水,180 r·min-1振荡1 h,4层纱布过滤制取孢子悬液,将孢子悬液进行适当稀释,显微计数,统计单位体积的孢子数,换算出每克菌剂中孢子数。

1.6.2 芽胞杆菌固体发酵将芽胞杆菌CW-02、XL-2分别接种到装有30 mL NA的100 mL三角瓶中,28 ℃、180 r·min-1培养24 h,制备种子悬液。将固体发酵基质装入三角瓶(20 g/250 mL),121 ℃灭菌 40 min,接种10%种子悬液。每24 h翻动1次,培养3 d后取样,镜检菌体形态,至95%形成芽孢后,取样进行稀释、涂布计数。

1.7 复合菌剂的筛选

利用育苗基质小盆栽试验筛选防控效果较佳的复合菌剂,调整单一菌剂的孢子或细胞数在同一个数量级,即109CFU·g-1,复合菌剂为单菌剂1∶1(体积比)混匀,每盆生防菌剂接种量5%,菌剂与育苗基质搅拌均匀。设置空白对照为不接生防菌处理,基质对照为不接菌处理(排除基质干扰)。在育苗基质盘中,播种杂交1代‘红矮生’番茄种子,每穴放置2颗露白的种子,在上面覆盖一层基质,用水浇透,置于温室中培育。待番茄苗长到3叶1心时,移栽到直径7.5 cm的小钵中,每钵装入100 g含菌剂的基质。番茄苗培养1周后,每钵接种10 mL(106CFU·g-1)青枯菌,每处理18钵。根据1.5节结果选择菌株,设置单一菌株(链霉菌WL-3、WL-4,芽胞杆菌CW-02、XL-2)及4株菌两两复合的组合,共12个处理。室内条件:白天温度 28～30 ℃,光照12 h;夜间温度23～25 ℃,黑暗12 h。开始发病后记录番茄的发病状况,病情稳定后计算植株发病率。

1.8 复合菌剂对番茄青枯病的防控效果及土壤细菌群落结构的影响

盆栽试验土壤采自南京郊区麒麟镇后村番茄种植园,土壤为黄棕壤,有机质含量31.74 g·kg-1,pH6.37。将土壤晾干、磨碎、过筛后备用。

设置复合菌剂组合(WL-4+CW-02)处理,以不加菌剂为空白对照,以单一菌剂WL-3、CY-1为对照。菌株CY-1拮抗植物病原真菌,不拮抗青枯菌;菌株WL-3拮抗青枯菌,不拮抗病原真菌。共4个处理,每处理24钵,生防菌剂接种量5%,将各菌剂与土壤混匀,每钵装入含200 g菌剂的土壤。在育苗盘中培育番茄苗,长到3叶1心时,选取大小一致的番茄苗移栽到盆钵中。室内条件同1.7节。1周后,接种20 mL 107CFU·L-1的青枯菌(终浓度为106CFU·g-1)。开始发病后统计番茄的发病情况并计算病情指数,番茄青枯病单株病情分级标准见文献[14]。发病稳定后取植株根际土,测定并分析各处理对根际土壤细菌群落结构的影响。

土壤高通量测序样品采集及分析:分别选取4个处理中的植株,去除表层土壤后,将番茄植株连同根部土壤一同拔出,去掉植株主体土,抖落并收集根部1～2 mm的根际土壤样品,充分混匀。取充分混匀的土壤样品0.50 g,采用EZNA®Soil DNA Kit(OMEGA)提取样品DNA,利用 NanoDrop 2000 检测抽提 DNA 浓度和纯度,A260/A280值为1.8～2.0。将符合要求的DNA样品送至上海凌恩生物科技有限公司进行土壤细菌高通量测序。

1.9 数据处理与分析

数据处理采用Excel 2010软件,采用SPSS Statistics 25.0软件进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 拮抗放线菌及拮抗细菌的初步鉴定

从土壤中筛选获得的2株放线菌WL-3、WL-4及2株细菌XL-2、CW-02,对青枯菌有显著的拮抗作用,如图1所示。

图1 放线菌及细菌对青枯菌的拮抗作用Fig.1 Inhibition effects of actinomycetes and bacteria against Ralstonia solanacearum

图2 菌株WL-3(A)及WL-4(B)孢子丝形态Fig.2 Morphological characteristics of strain WL-3(A)and WL-4(B)spore filament

图3 菌株WL-3(A)、WL-4(B)的16S rRNA系统发育树Fig.3 The phylogeny trees of strains WL-3(A),WL-4(B)by using 16S rRNA gene sequences

2.1.1 放线菌的初步鉴定放线菌形态学特征:菌株WL-3在燕麦培养基上气生菌丝呈粉红色,菌落形状为不规则圆形,电镜观察其孢子丝呈直链状,孢子为圆柱形(图2-A);菌株WL-4在燕麦培养基上菌落呈规则圆形,边缘整齐,表面有褶皱,气生菌丝前期呈淡绿色,后期逐渐变为灰绿色,电镜观察孢子丝为螺旋状,分生孢子为椭圆形(图2-B)。对菌株WL-3、WL-4的16S rRNA基因测序,并选取同源性高的相关序列信息进行系统发育分析,如图3所示,菌株WL-3(登录号:MW316590)与玫瑰绿链霉菌(Streptomycesroseoviridis)序列相似性为99.0%;菌株WL-4(MW 721131)与孟加拉链霉菌(S.bangladeshensis)相似性为98.0%。2株菌初步鉴定为链霉菌(Streptomycessp.)。

2.1.2 兼具拮抗及促生作用的细菌鉴定从土壤中筛选出2株对青枯菌具有拮抗效果的细菌菌株XL-2、CW-02,对青枯菌的拮抗效果见图1。2株菌在NA平板上均为乳白色菌落,边缘整齐,呈圆形,简单染色,镜检发现XL-2端生芽孢,CW-02中生芽孢(菌体形态图略)。通过菌株XL-2、CW-02的16S rRNA基因序列测序,菌株XL-2(ON209529)与贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)序列相似性为 99.0%,菌株CW-02(ON209527)与萎缩芽胞杆菌(B.atrophaeus)序列相似性为 99.0%。2株菌初步鉴定为芽胞杆菌(Bacillussp.)。

2.2 放线菌WL-3、WL-4对青枯菌分泌胞外多聚物的影响

通过透射电镜观察发现,经菌株WL-3、WL-4发酵上清液处理后,与对照相比青枯菌的荚膜厚度明显变薄(图4),说明拮抗菌株的代谢产物能显著抑制青枯菌胞外多聚物的分泌。

图4 WL-3(A)、WL-4(B)及对照处理(C)对青枯菌形态的影响Fig.4 Effects of WL-3(A),WL-4(B)and control(C)on the morphology of R.solanacearum

2.3 芽胞杆菌的生物学特征

从表1可知:菌株XL-2、CW-02分泌铁载体能力较强,定性检测IAA均为阳性。在H2O2耐受性试验中,2株菌在含0.4% H2O2条件下仍能较好生长,表明其对H2O2耐受性较高,菌株具有较高的SOD活性。菌株XL-2、CW-02的SOD活性分别为116.72和120.88 U·mL-1。

表1 芽胞杆菌的植物促生特性及对H2O2耐受性Table 1 Plant growth-related properties and hydrogen peroxide tolerance of the Bacillus spp.

2.4 放线菌WL-3、WL-4与芽胞杆菌XL-2、CW-02菌株间的相容性

4株菌间的相容性结果(图5)显示:菌株WL-3对XL-2有抑制作用;菌株WL-4、CW-02与XL-2交叉处正常生长,菌株间没有拮抗作用;2株芽胞杆菌对链霉菌WL-3生长有抑制作用。

图5 菌株WL-3、WL-4、CW-02及XL-2的相容性Fig.5 Compatibility of strain WL-3,WL-4,CW-02 and XL-2

2.5 拮抗菌株的固体发酵

经预试验发现,玉米粉、黄豆粉、麦麸与稻壳较适宜链霉菌生长。通过各基质在不同水平上孢子数量的比较,获得WL-3固体菌剂最佳发酵配方:25%玉米粉,5%黄豆粉,70%麦麸+稻壳(质量比为1∶3),料水比为1∶1,pH7.5。将培养48 h的WL-3种子液接入固体发酵基质,接种量为10%,28 ℃发酵14 d后,孢子量1.58×109CFU·g-1,菌剂呈暗棕色,有土腥气味产生。WL-4固体发酵配方:20%玉米粉,15%黄豆粉,65%(麦麸、稻壳的质量比为1∶2),料水比为1∶1,pH7.5。将培养60 h的WL-4种子液接入固体发酵基质,接种量为10%,28 ℃发酵14 d后,孢子量2.0×109CFU·g-1,菌剂呈灰色,有强烈的土腥气味产生。

根据预试验结果,确定芽胞杆菌的固体发酵条件。菌株XL-2与CW-02配方:麦麸、玉米粉、米糠的质量比为8∶1∶1,料水比为1∶1,接种量10%,培养3 d。菌剂XL-2细菌数量达2.3×1010CFU·g-1;菌剂CW-02细菌数量达9.0×109CFU·g-1。

2.6 复合菌剂的筛选

利用育苗基质盆栽试验,筛选出最佳的菌剂组合。从图6可以看出:对照(CK)植株发病率为78.00%,菌剂WL-3处理植株发病率为44.44%,复合菌剂CW-02+WL-4(C+4)处理植株发病率为30.00%。单菌剂CW-02、WL-4处理发病率分别为55.56%、66.67%,防控效果较复合菌剂CW-02+WL-4处理差,复合菌剂显示出较强的协同作用。而复合菌剂CW-02+XL-2(C+X)、XL-2+WL-3(X+3)、WL-3+WL-4(3+4)发病率与其对应的单菌剂没有显著差异,未表现出明显的协同作用。所以选择复合菌剂CW-02+WL-4进行后续试验。

图6 不同处理对番茄植株青枯病发病率的影响Fig.6 Effects of different treatments on incidence rate of tomato bacterial wilt1)CK:空白对照Blank control;Medium:基质对照Matrix control;C+3:CW-02+WL-3;C+4:CW-02+WL-4;C+X:CW-02+XL-2;X+3:XL-2+WL-3;X+4:XL-2+WL-4;3+4:WL-3+WL-4. 下同。The same as follows. 2)不同小写字母表示在0.05水平差异显著。Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level.

2.7 复合菌剂对番茄青枯病的防控效果及根际细菌群落结构的影响

2.7.1 复合菌剂对番茄青枯病的防控效果从图7可知:发病初期,空白对照番茄的病情指数高于各菌剂处理,植株发病迅速。随着种植时间的延长,各处理番茄的病情指数逐渐增加,15 d左右病情开始稳定,复合菌剂处理的病情指数为41.21%,防控效果为45.58%。单菌剂WL-3处理情况相似,在14 d左右病情趋于稳定,病情指数为50.17,防控效果为33.75%。单菌剂CY-1(对照)处理,其在室内平板对峙试验中未表现出对青枯菌的拮抗作用,但在盆栽试验中具有一定的防控效果,其病情指数为60.00,防效为20%左右。空白对照在15 d时病情指数为65.63,在18 d时病情才趋于稳定,病情指数为75.73。

图7 不同处理番茄的病情指数Fig.7 Disease indexes of tomato plant with different treatments

2.7.2 复合菌剂对番茄根际土壤细菌群落结构的影响从图8-A、B可知:复合菌剂CW-02+WL-4、单菌剂WL-3与CY-1的土壤细菌群落丰度(Chao1)与多样性(Shannon)均高于空白对照(CK),表明添加菌剂显著提高土壤细菌群落的丰富度与多样性。其中复合菌剂群落丰度(Chao1)最高,相对于CK提高5.30%,而复合菌剂CW-02+WL-4、单菌剂WL-3和CY-1处理的Shannon指数相对于CK分别提高5.00%、4.44%和3.24%。

从图8-C可以看出:不同处理群落组成大致相同,但相对丰度有较大差异。丰度较高的前10个细菌门分别为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、浮霉菌门(Planctomycetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、黏球菌门(Myxococcota)。施用菌剂后变形菌门的丰度显著高于CK,其在WL-3菌剂处理中相对丰度最高,为46.79%,在复合菌剂中为41.11%,在CY-1菌剂中为38.38%,而在CK中仅占28.05%。酸杆菌门各菌剂处理均低于CK:复合菌剂与WL-3菌剂相对丰度分别为8.72%和11.79%,CK高达17.13%。拟杆菌门、芽单胞菌门等相对于CK差异不明显。结果表明施用菌剂能够影响部分根际土壤细菌门水平的相对丰度。

不同菌剂处理对根际土壤细菌属水平的影响,优势菌属如图8-D所示。复合菌剂处理中Sphingomonas相对丰度为4.23%,Pseudomonas为4.85%,Bacillus为1.84%;WL-3菌剂处理中Sphingomonas相对丰度最高,为7.88%,Streptomyces为1.59%;CY-1菌剂处理的Sphingomonas相对丰度为6.91%,Nitrospira为 1.21%;CK中Sphingomonas与Pseudomonas相对丰度分别为3.58%和1.05%,均低于3种菌剂处理,而Ralstonia相对丰度为2.74%,均高于3种菌剂处理,表明菌剂处理能显著降低病原菌属的相对丰度,提高有益菌属的相对丰度。

图8 不同处理对根际土壤细菌α多样性(A、B)、门水平的群落组成(C)和优势菌属相对丰度(D)的影响Fig.8 Effects of different treatments on rhizosphere soil bacterial α diversity(A,B),community composition at phylum level(C)and abundance of dominant bacteria(D)

3 讨论

生防菌剂是防控番茄青枯病的重要措施,土壤放线菌在生物防治中表现出巨大的潜力。本研究从番茄种植区土壤中筛选出2株拮抗放线菌WL-3、 WL-4,初步鉴定为链霉菌(Streptomycessp.)。链霉菌WL-3、WL-4不仅抑制青枯菌的生长,经透射电镜观察细胞形态,发现其发酵上清液还影响青枯菌胞外多糖的分泌量。El-Shirbiny等[15]曾证明玫瑰绿链霉菌能够促进小麦生长,但利用玫瑰绿链霉菌防控青枯病鲜有报道。Al-Bari 等[16]研究发现孟加拉链霉菌AAB-4能够代谢产生邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯,可以拮抗细菌和真菌。链霉菌WL-3、WL-4产生活性物质的作用有待进一步检测。

连作障碍造成的土壤盐渍化会使植物遭受逆境伤害,活性氧(ROS)含量增加,发生膜脂过氧化作用,细胞生物膜受损[17]。超氧化物歧化酶(SOD)是生物体防御氧化损伤的一种金属酶,对自由基具有强烈清除作用。功能微生物细胞在根际定殖,菌体如产生SOD,能催化ROS发生歧化反应,减少ROS对植物的伤害,具有促进植物生长、防治植物病害的作用。本试验筛选获得2株芽胞杆菌,产SOD活性高且拮抗青枯菌,同时能够分泌铁载体与IAA。已有研究发现萎缩芽胞杆菌能够产生多种具有生物活性的代谢产物,如细菌素、脂肽、几丁质酶及铁载体、生长素、赤霉素等,促进植株的生长,并具有较好生防潜力[18-19]。Khan等[20]研究发现贝莱斯芽胞杆菌能产生高效的抗氧化肽,具有蛋白酶、葡聚糖酶和纤维素酶等多种水解酶活性。

青枯病暴发的主要原因是植物根际有益菌群数量的减少、细菌多样性的降低和植物病原菌的积累。在控制植物病害方面,2种或2种以上有益微生物的联合应用比单一微生物的应用效果好[21]。Santiago等[22]报道一些微生物组合提供了对多种作物的广谱保护,并改善其生长,提高其产量和品质。本研究筛选出芽胞杆菌与链霉菌组合(CW-02+WL-4),2种菌之间无拮抗作用,相对于单一菌剂处理,复合菌剂处理表现出明显的协同效应,为植物病害的综合防治提供了新的选择。植物健康与土壤微生物群落多样性呈正相关,在番茄根际土壤中存在一个稳定而复杂的菌群网络维持番茄植株的健康,有助于防止青枯菌感染[23]。青枯菌的入侵会破坏根际细菌群落结构,导致非致病性细菌的多样性和丰度明显下降,而复合菌剂的应用能够提高土壤微生物群落多样性,增加OTU数量和Chao1、Shannon指数[24-25]。本研究利用高通量测序检测菌剂对土壤细菌群落的影响,结果发现施用单一菌剂及复合菌剂后土壤中变形菌门与放线菌门等的相对丰度增加。Qi等[26]研究发现健康土壤网络中放线菌门、芽单胞菌门、变形菌门的比例均高于发病土壤。在属水平上,相对于空白对照,单菌剂与复合菌剂处理的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)与假单胞菌属(Pseudomonas)相对丰度均在较高水平,鞘氨醇单胞菌属具有抑制土传疾病和产生植物激素类化合物的作用[27];而劳尔氏菌属相对丰度均低于对照,表明菌剂处理能显著降低病原菌属的丰度。Dong等[28]研究发现,在微聚集体中,劳尔氏菌属的相对丰度与青枯病发病率呈显著正相关。盆栽试验中,选择单一菌株WL-3作为对照,是初筛时由于菌株WL-3处理效果优于菌株WL-4,其与复合菌株(CW-02+WL-4)比较,如果对照再设置WL-4处理就更有说服力。对照菌株链霉菌(S.yetensis)CY-1,其主要抑制植物病原真菌,在平板对峙试验中对青枯菌无明显拮抗作用,但在盆栽试验中作为对照处理,却显示出对青枯病具有一定的防控效果(20%),从细菌的群落结构分析上看,其可能原因是改善了根际的微生物区系,从而间接减弱了青枯病的发生,也从侧面验证了改善根际微生物区系可减低病害发生的程度。