发酵肉用乳酸菌培养基中碳源的优化

郭 瑞 李怡阳 李亚楠 石晶红

河套学院 内蒙古巴彦淖尔 015000

乳酸菌培养基是乳酸菌的培养材料，在乳酸菌发酵制品生产过程中起着非常重要的作用。乳酸菌发酵制品质量的好坏主要取决于乳酸菌的品质、类型及活力。直投式乳酸菌培养基能够直接、安全有效的生产发酵制品，能够更有效的保障消费者的利益和健康。

实验以河套学院食品微生物实验室分离纯化出的发酵肉制品用植物乳杆菌为种子菌株,将MRS培养基中的碳源替换为廉价的食品原料，为可以直接应用于发酵肉制品中的乳酸菌直投式培养基筛选出最佳的食品级碳源，为推动发酵肉制品工业的发展尽一份力。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

苹果皮、菠萝皮、梨皮，本地水果店赠送；

红枣，市售；

白酒酒糟、大米小米醪糟、大米糯米醪糟、糯米小米醪糟，河套学院农学系农产品加工实验室提供；

植物乳杆菌，河套学院农学系食品微生物实验室提供；

NaOH、酚酞、硫酸镁，天津市凯通化学试剂有限公司；

无水乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸锰，天津市北联精细化学品开发有限公司；

无水葡萄糖、吐温80，天津市永大化学试剂有限公司；

牛肉膏、酵母浸粉、蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；

柠檬酸铵，天津市凯通化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

电子天平，TD5002A，天津天马衡基仪器有限公司；

电子分析天平，艾德姆衡器(武汉)有限公司；

立式压力蒸汽灭菌器，LDZX-30KB，上海申安医疗器械厂；

电热恒温培养箱，SKP-01，湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司；

超净工作台，智城ZHJH-C1112B，上海智城分析仪器制造有限公司；

漩涡混合器，海门市麒麟医用仪器厂；

分光光度计723，上海凤凰光学科仪有限公司；

料理机，JYL-C19V型，九阳股份有限公司。

1.3 菌种的活化

将发酵肉用植物乳杆菌在MRS液体培养基中活化两代，37℃培养16.5h。

1.4 原料的处理

分别称取固体食品原料75g，加入500mL蒸馏水于料理机中打碎，煮沸30min后过滤，取其滤液备用。

1.5 不同食品级碳源对发酵肉用乳酸菌生长的影响

将液体MRS培养基中的无水葡萄糖用食品原料滤液代替，添加量分别为65%、75%和85%(体积比)，接种1%的发酵肉用植物乳杆菌，培养温度为37℃，连续培养13h。空白对照为MRS培养基。每1h取样测定菌液吸光值和滴定酸度。

1.6 最佳食品级碳源的筛选

将液体MRS培养基中的无水葡萄糖用筛选出的食品原料滤液代替，接种植物乳杆菌，接种量为1%，37℃培养13h。以MRS培养基作为空白对照。每1h取样测定菌液吸光值和滴定酸度。优化液体培养基中的食品级碳源最佳添加量。

1.7 菌液吸光值的测定

取3mL混合均匀的菌悬液到比色皿中，用分光光度计在600nm处测定菌悬液的浊度，记录其吸光值。

1.8 滴定酸度的测定

乳酸菌分解培养基中的糖，生成以乳酸为主要成分的有机酸，实验采用酸碱滴定法测定不同食品级碳源的培养基，在培养乳酸菌的过程中酸度的变化。

滴定酸度的测定按照GB12456-2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》[1]方法测定。

2 结果与分析

2.1 发酵肉用乳酸菌培养基中食品级碳源的筛选

苹果、菠萝、梨在鲜食或加工过程中产生大量的皮渣，被直接丢弃，造成了严重的环境污染和资源浪费，而这些果皮营养丰富，其所含水分、柠檬酸和总糖等成分比例与果肉相似，此外还含有丰富的膳食纤维、多糖、多酚等生物活性成分，可为植物乳杆菌的生长提供碳源和其他营养物质。

白酒酒糟和醪糟分别是蒸馏白酒和米酒后生产的副产物，在发酵过程中粮食原料中的淀粉被水解为单糖，经过酒精发酵和蒸馏之后，未被利用的残糖可为植物乳杆菌生长提供碳源。

不同食品级碳源对植物乳杆菌生长的影响见图1所示。

图1 不同食品级碳源对植物乳杆菌生长的影响

不同碳源对植物乳杆菌液酸度的影响见图2所示。

图2 不同碳源对植物乳杆菌液酸度的影响

样品滤液糖度值见表1。

表1 样品滤液糖度值

通过分析图1、图2和表1可知，白酒酒糟作为碳源的植物乳杆菌的生长明显受到抑制。白酒酒糟作为蒸馏白酒的废弃物，酒糟中的糖已基本转化为乙醇，残糖含量不高，其熬煮后的滤液的糖含量为1.3°Bx，远低于其他几种碳源，其在同等条件下提供的碳源含量无法满足植物乳杆菌生长所需。红枣中的红枣多糖含量高，但其作为潜在的天然益生元，可促进短链脂肪酸生成[2]，导致乳酸菌生长过程中升酸快，后期抑制了乳酸菌的生长。因此虽然红枣滤液中的糖含量较高，达到8.2°Bx，但其作为碳源培养的植物乳杆菌表现出的生长性能低于MRS培养基。

苹果皮、梨皮、大米小米醪糟、大米糯米醪糟和糯米小米醪糟作为碳源的培养基中，植物乳杆菌均表现出优于MRS培养基的生长性能。不同碳源培养基中植物乳杆菌的生长曲线见图3所示。

图3 不同碳源培养基中植物乳杆菌的生长曲线

其中添加了苹果皮滤液85%、梨皮滤液85%、大米小米醪糟滤液65%、大米糯米醪糟滤液65%和糯米小米醪糟滤液75%，作为碳源的植物乳杆菌的OD600均高于对照MRS，将其绘制生长曲线进行对比(图3)后发现：三种醪糟作为碳源的培养基中植物乳杆菌的生长速度是低于MRS对照的，且都经过了3h的生长迟滞期。同时这三种培养基本身带有酒糟中的邪杂味，应用在直投式培养基中会对发酵肉制品的风味造成不良的影响。添加苹果皮滤液85%和梨皮滤液85%作为碳源的培养基中植物乳杆菌的生长速度快，明显优于MRS对照，且分别于接种后1h内即进入对数生长期，于7h左右进入对数生长末期。其中苹果皮滤液85%作为碳源的培养基中植物乳杆菌的生长情况最佳。

2.2 最佳食品级碳源的优化

苹果皮作为碳源对植物乳杆菌生长的影响见图4所示。

图4 苹果皮作为碳源对植物乳杆菌生长的影响

苹果皮作为碳源的培养基中植物乳杆菌生长过程中酸度的变化见图5所示。

图5 苹果皮作为碳源的培养基中植物乳杆菌生长过程中酸度的变化

通过分析图4和图5可知，苹果皮滤液作为碳源的培养基中，植物乳杆菌均表现出优于MRS培养基的生长性能，且生长曲线非常接近。其中添加90%苹果皮滤液作为碳源的培养基中植物乳杆菌的生长性能最佳，且在1h内即进入对数生长期。添加95%苹果皮滤液作为碳源的培养基中植物乳杆菌经过了1h的迟滞期，说明其碳源添加量可能偏高，植物乳杆菌需要时间适应，进入对数生长期后植物乳杆菌生长速度快，菌液浓度升高，导致培养液中乳酸快速积累，植物乳杆菌的繁殖受到抑制，在对数生长末期菌液浓度低于添加90%苹果皮滤液的培养基。苹果皮中含有丰富的低聚果糖和乳果糖，这两类物质已被大量的研究证明可以作为乳酸菌发酵过程中的益生元，苹果皮的汁液中还存在绿原酸、阿魏酸、儿茶素和缩合单宁等酚类物质，这些物质均有利于乳酸菌的生长繁殖[3]。

3 结论

通过对实验结果进行分析表明，苹果皮加水打碎，煮沸30min后获得糖度值为9.7°Bx的滤液。添加此滤液90%可以替代MRS液体培养基中的全部葡萄糖作为碳源培养发酵肉用乳酸菌，且生长性能优于MRS培养基。

MRS培养基中提供碳源的物质是葡萄糖，葡萄糖是一种单糖，选取不同的食品原料代替葡萄糖作为乳酸菌培养基的碳源后，提供碳源的物质变得更加丰富，除了单糖之外还有各种多糖和具有生理活性的低聚糖，这些种类丰富的糖类不仅为乳酸菌提供了生长必须的碳源，还提供了可以作为促生长因子的其他物质成分。以苹果皮、菠萝皮、梨皮等作为发酵肉用乳酸菌的培养基碳源都对乳酸菌生长起到了一定的促进作用。然而，这些可以作为供给乳酸菌生长的碳源物质，虽然有丰富的营养成分，却存在着一些问题，如菠萝皮和橙子皮，它们天然的黄色色泽较难去除，苹果氧化后产生的褐变等都可能影响发酵肉制品的感官品质。因此，有必要进一步研究并优化这些食品级碳源原料的处理制备方法，使它们即有利于发酵肉用乳酸菌的培养增殖，又不影响发酵肉制品的产品品质，从而最大限度的发挥出其作用。