液相色谱-串联质谱法测定鲈鱼中磺胺二甲嘧啶的不确定度评定

窦明理 夏玉吉 黄 萍 王 明 陶 滔 王 毅*

1.四川省食品检验研究院 四川成都 611731 2.国家市场监管重点实验室(白酒监管技术) 四川成都 611731

鲈鱼以其鲜美的肉质、丰富的营养价值作为重要的经济鱼类，近些年来得到广泛养殖。在养殖过程中由于养殖密度大、投饵量大、排泄物较多、死亡鱼体未及时清除以及其他诸多原因会导致养殖群体患病，增加死亡率[1]。磺胺类药物是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，具有稳定、抗菌谱广、价廉等优点而广泛使用，其能够抑制大多数革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌[2，3]。已有多种磺胺类衍生物作为抗菌药物应用于水产养殖和集约化畜牧业[4，5]。其对水产养殖中的细菌性竖鳞病、烂鳃病、鞭毛虫病等有良好的防治效果[6]。然而磺胺类药物的大剂量使用和不遵守休药期的规定会导致可食动物组织中残留的磺胺超标[7]。磺胺类药物不易代谢，很容易在动物体内蓄积，进而对人体健康造成危害[8]。其会对人体有泌尿系统及肝损害、胃肠道及消化系统不良症、过敏症状、溶血性贫血、再生障碍性贫血等严重反应[9，10]。GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药残留最大限量》中明确指出了磺胺二甲嘧啶和磺胺类总量的残留限量[11]。

测量不确定度是表征赋予被测量值分散性的非负参数，能够表明对测量结果有效性信心的增加[12，13]。食品检验工作是食品安全监管，维护舌尖安全的有力保障，测量不确定度在食品检验工作中的运用十分广泛。

本研究以磺胺类药物中磺胺二甲嘧啶为代表，氘代磺胺邻二甲氧嘧啶为内标，采用液相色谱-串联质谱法对鲈鱼样品进行检测，根据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示指南》，建立数学模型，对不确定度来源进行评定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

磺胺二甲嘧啶标准品，阿尔塔科技有限公司；

氘代磺胺邻二甲氧嘧啶标准品，阿尔塔科技有限公司；

甲醇，Fisher chemical公司；

乙腈，Fisher chemical公司；

甲酸，Sigma-Aldrich公司；

液相色谱-串联质谱仪，美国安捷伦科技有限公司；

电子天平，美国梅特勒-托利多仪器有限公司；

高速离心机，美国Thermo Scientific公司。

1.2 试验方法

准确称取鲈鱼样品5g，置于50mL聚丙烯离心管中，加入600ng氘代磺胺邻二甲氧嘧啶内标，涡旋混合1min，避光放置10min，加入20mL含1%甲酸的乙腈，涡旋混匀，再加入10g无水硫酸钠，超声振荡提取20min，8 000r/min离心5min，将上清液收集至50mL刻度离心管中，残渣加入20mL含1%甲酸的乙腈；重复提取一次，合并两次提取液，加入10mL乙腈饱和正己烷，涡旋1min，静置分层，弃去上层正己烷，乙腈层再用10mL乙腈饱和正己烷重复提取一次，弃去正己烷，乙腈层于40℃下旋转浓缩至近干，残渣用乙腈转移至20mL容量瓶定容摇匀，过0.22μm有机滤膜，供液相色谱-串联质谱分析测定。

1.3 液相色谱-串联质谱条件

1.3.1 液相色谱条件

液相色谱条件：色谱柱，Agilent ZORBAX Ecilipse Plus C18Rapid Resolution HD 3.0×150mm 1.8μm；流动相:(A)0.2%甲酸水溶液，(B)0.2%甲酸乙腈；流速0.5mL/min；进样量2μL；柱温40℃；洗脱梯度见表1。

表1 洗脱条件

1.3.2 质谱条件

离子源，电喷雾(ESI+)；监测模式，多反应监测(MRM)；毛细管电压3 500V，干燥气温度350℃，干燥气流速10L/min，鞘气温度320℃，鞘气流速10L/min。定性离子对、定量离子对等质谱参数见表2所示。

表2 质谱参数

1.4 不确定度来源分析

建立鲈鱼样品中磺胺二甲嘧啶含量的数学模型，如公式(1)。

(1)

式中：X为试样中磺胺二甲嘧啶的含量，单位为μg/kg；

C为试样提取液中磺胺二甲嘧啶的浓度，单位为ng/mL；

V为试样定容体积，单位为mL；

m为称样量，单位为g；

R为稀释倍数。

根据数学模型(1)可知，液相色谱-串联质谱法检测鲈鱼样品中磺胺二甲嘧啶的测量不确定度引入途径包括重复测量引入、回收率引入、校正曲线拟合引入、校正溶液配制引入、样品称量定容前处理操作引入、检测仪器引入等。

2 结果与分析

2.1 不确定度分量计算

2.1.1 测量重复性引入的不确定度分量

称取6份鲈鱼试样，进行处理后测定分析，得到检测结果分别为170.2、173.5、164.2、164.8、162.8、162.6μg/kg，平均含量为166μg/kg。

据根贝塞尔公式，测量重复性引起的标准不确定度按公式(2)计算。

(2)

相对标准不确定度按公式(3)计算。

(3)

2.1.2 回收率引入的不确定度分量

称取6份鲈鱼空白试样，进行处理后测定分析，得到回收率分别为99.40%、101.13%、102.00%、94.70%、101.34%、90.79%，平均回收率为98.2%。

据根贝塞尔公式，回收率引起的标准不确定度按公式(4)计算。

(4)

回收率引起的相对标准不确定度按公式(5)计算。

(5)

2.1.3 校正曲线拟合引入的测量不确定度分量

校正曲线以磺胺二甲嘧啶与氘代磺胺邻二甲氧嘧啶的响应比值为纵坐标，磺胺二甲嘧啶与氘代磺胺邻二甲氧嘧啶的浓度比值为横坐标，校正溶液浓度及峰响应见表3，拟合得线性回归方程为：A=0.043552+0.028415C，r2=0.9985。

表3 校正溶液峰响应

由校正曲线引起的标准不确定度分量按公式(6)、公式(7)计算。

(6)

(7)

公式(6)和(7)中：

a=0.043552；

b=0.028415；

P为试液测量次数，为6;

n为校正溶液测量次数，为7;

C0为样品浓度平均值，为41.7654ng/mL。

代入数据，校正曲线的标准差SR=0.08703，校正曲线标准引入不确定度为：u(3)=1.7164，则相对标准不确定度按公式(8)计算。

(8)

2.1.4 校正溶液配制引入的测量不确定度分量

根据磺胺二甲嘧啶标准物质证书，可知浓度为100.2μg/mL，扩展不确定度±5%(k=2)，则标准物质引入的分量按公式(9)计算。

(9)

准确吸取含磺胺二甲嘧啶100.2μg/mL和含氘代磺胺邻二甲氧嘧啶100μg/mL的标准溶液100μL，分别用乙腈定容至10mL容量瓶中，得到浓度为1.002μg/mL的外标储备液和1μg/mL的内标储备液。分别吸取上述外标储备液2、4、10、20、40、100、200μL，各加入上述内标储备液30μL，氮气吹干后精密加入1mL空白基质溶液(空白基质溶液按照样品相同处理获得)复溶，混匀即得到基质标准曲线，浓度为2.004、4.008、10.02、20.04、40.08、100.2、200.4ng/mL。

标准溶液配制过程中，内标仅在最后加入30μL时会产生不确定度，储备液配制过程的不确定度不需要考虑。操作时室温控制为20±5℃，乙腈体积膨胀系数为1.37×10-3，检测过程中移液器使用、容量瓶定容时乙腈体积均会受到温度影响，会导致体积变化，假定为均匀分布。而移液枪头、玻璃器皿的膨胀系数很小，可忽略不计。

温度变化引入的相对不确定按公式(10)计算。

(10)

移液器使用引入的相对不确定度见表4。

表4 标准溶液配制移液器引入的不确定度

采用10mL容量瓶的容量允差为0.020mL，按均匀分布处理，则容量瓶引入相对不确定度按公式(11)计算。

(11)

标准溶液引入的相对不确定度按公式(12)计算。

(12)

2.1.5 样品前处理引入的相对不确定度

样品称取过程用的电子天平检定证书给出不确定度为1.0mg，k=2；称样量为5g，则其相对不确定度按公式(13)计算。

(13)

样品加入600μL的1μg/mL内标后，进行前处理，根据检定证书，采用移液器不确定度为0.504μL，k=2，则移液器添加内标引入相对不确定度按公式(14)计算。

(14)

残渣用乙腈复溶后定容至20mL容量瓶，20mL容量瓶容量允差为0.03mL，按均匀分布处理，则其引入不确定度按公式(15)计算。

(15)

样品前处理引入的相对不确定度按公式(16)计算。

(16)

2.1.6 检测仪器引入的相对不确定度

检测仪器为液相色谱-串联质谱仪，检定证书给出的不确定度为U=5%，k=2，则其相对不确定度按公式(17)计算。

(17)

2.2 合成标准不确定度

根据上述得到的标准不确定度分量，合成相对标准不确定度为按公式(18)计算。

urel=

(18)

u=urel×166=10.4 μg/kg

(19)

2.3 扩展不确定度U

取置信概率p=95%，包含因子k=2，扩展不确定度按公式(20)计算。

U=u×k=21 μg/kg

(20)

评定结果可表示为X=(166±21)μg/kg，k=2。

3 结论

本研究建立了以氘代磺胺邻二甲氧嘧啶为内标，采用液相色谱-串联质谱法对鲈鱼样品中磺胺二甲嘧啶进行检测，并建立数学模型，对其不确定度进行评定，可以为其他磺胺类药物的检测与不确定度评定提供科学依据。

当鲈鱼样品中磺胺二甲嘧啶含量为166μg/kg时，扩展不确定度为21μg/kg，k=2。在测定磺胺二甲嘧啶时，不确定度来源主要有重复测量引入、回收率引入、校正曲线拟合引入、校正溶液的配制过程引入、前处理操作引入以及检测仪器引入等。研究结果表明，校正曲线拟合、校正溶液配制和检测仪器对不确定度的贡献最大，测量重复性、回收率和前处理过程对不确定度影响也不可忽视。因此，实验室为保证结果的可靠性，在实验过程中应严格把控校正曲线拟合过程和标准溶液配制过程，并及时对所使用的检测仪器进行检定校准，必要时可以增加平行测定次数，采用规范的前处理操作过程都可以有效保证结果的可靠性。