基于蒽的衍生物的合成与性能研究

＊王宏亮 苏晓蕊 孙晓敏 薛婧婧 宋佳星 张晓娟

（忻州师范学院 山西 034000）

1.研究背景

谷胱甘肽（GSH）是有机体中许多小分子的重要组成部分[1]。有抵抗氧化和清除自由基的功能，作用十分重要。近年来，很多荧光探针都有了谷胱甘肽的身影。然而，在氧化应激条件下，谷胱甘肽水平经常升高，对ROS/RNS损伤的敏感性与谷胱甘肽水平密切相关。在这一方面，谷胱甘肽稳态失调已被确定可以成为许多的指标[2-3]。鉴于这些硫醇在生物学上的重要性，我们有兴趣开发合适的荧光探针，以实现其对谷胱甘肽的选择性测量和定位。传统的电化学方法、液相色谱法需要大量精确的样本，且只能检测到硫醇的总量。荧光分析法，也具有直接标记活细胞的优点，检测限低而且易于操作，成为当前检测硫醇分子最被广泛使用的一种方法[4-5]。这次实验的主要内容是合成一种开启型荧光探针，检测机理是“巯基对缺电子芳环的亲核取代”[6]。基于此，我们开发了一种反应后发出黄色荧光的开启型荧光探针，以9-蒽甲醛衍生物为荧光团，与2,4-二硝基苯磺酰氯发生一个反应，荧光猝灭，使目标探针分子身几乎没有荧光，紫外灯照射下基本看不见其发光。该探针的荧光开启响应来自于它与谷胱甘肽的反应，加入响应物质之后，巯基本身由于非常强的亲核能力，导致磺酸酯键极易断裂，荧光探针的主体结构恢复，从而荧光增强[7]。

当某一指定物质，吸收了外界给它的能量之后，会释放出不同强度、不同波长的光，就是我们所说的“荧光”[8]。可以说是这一物质吸收了特定波长入射光的能量，紧接着又发出波长更长的光。物质吸收了紫外光之后可以发出紫外荧光或可见荧光，可以发现它们的波长变化，就是比紫外波长更长，如果是吸收了波长较短的可见光，那么就可以发射出波长变化更加大、更长的可见荧光[9]。

荧光探针是荧光性质可以随着所处环境变化而变化的一类荧光分子。荧光探针的应用在我们的生产、生活中非常广泛[10]。荧光探针不仅在化学应用，在生物、环境领域也发挥了很大的作用。荧光探针通常是由识别基团、荧光基团和连接体部分组成，当与被检测物质接触时可以看到探针荧光信号的变化，从而实现对被检测物质的定性与定量。在生物化学和环境检测研究上具有重要意义[11-12]。9-蒽甲醛衍生物是一种稳定的光化学物质，具有良好的荧光性能，基于此我们开发了一种亮黄色的荧光探针。9-蒽甲醛衍生物与2,4-二硝基苯磺酰氯反应生成一种荧光探针，可以称为“磺酸脂”用于检测存在于生物活细胞中的硫醇分子。2,4-二硝基苯磺酰氯的吸电子能力很强，可以让荧光团荧光猝灭。加入被检测的物质以后，由于硫醇分子中的巯基的强亲核作用，发生一个反应使合成的探针分子磺酸酯键断裂，导致荧光探针发光主体结构恢复，荧光逐渐变强。9-蒽甲醛衍生物原料便宜易得、制备方法简便、条件温和，有良好的应用前景。该类材料的生产在生物与环境检测的应用具有重要作用及意义[13]。

2.实验部分

(1)仪器

电热鼓风干燥箱（天津市，三水科学仪器有限公司）；数显智能控温磁力搅拌器（上海市，予名仪器设备有限公司）；WFH2 204B型手提式紫外灯（上海精科有限公司）；循环水式真空泵（巩义市，予华仪器有限责任公司）；Bruker AV-400型超导核磁共振仪（德国，Bruker公司）；F-4600荧光分光光度计（日本日立公司）。

(2)原料与试剂

原料：对羟基苯乙腈；4-甲基苯磺酸吡啶；3,4-二氢-2H吡喃；9-蒽甲醛；2,4-二硝基苯磺酰氯；三乙胺（以上原料均购买于萨恩化学技术（上海）有限公司，中国）；试剂：无水乙醇（99%）；二氯甲烷；四氢呋喃；氢氧化钠（96%）（以上试剂均购买于天津欧博凯化工有限公司，中国）除特别注明以外，均未经处理直接使用。

(3)实验内容

①合成路线

②合成步骤

A.中间体1的合成

量取对羟基苯乙腈（3g，0.014mol）和4-甲基苯磺酸吡啶（2.83g，0.011mol）于100mL茄形瓶中，加入溶剂二氯甲烷50mL，搅匀。在冰水浴条件下滴加（3.08mL，0.035mol）3,4-二氢-2H吡喃，室温下搅拌12h。反应结束后，先用水萃取三次洗去4-甲基苯磺酸吡啶盐，再用饱和碳酸钠水溶液洗去未反应完的原料对羟基苯乙腈，最后，取洗涤过的有机相旋干，固体用石油醚超声洗涤除去3,4-二氢-2H吡喃。产物自然晾干，得产物2.5g，产率为62.6%。

B.中间体2的合成

称取9-蒽甲醛（0.5g，0.0024mol）和中间体1（0.58g，0.0026mol）于有冷凝装置的100mL茄形瓶中，取50mL无水乙醇作溶剂，超声10min使其充分溶解。取氢氧化钠固体（0.097g，0.0024mol）于10mL无水乙醇中，超声使其溶解后滴加于反应体系，室温下搅拌过夜。反应结束后先抽滤，用水洗涤后用无水乙醇洗涤得固体，烘干后得产物0.6g，产率为61.7%。

C.中间体3的合成

称取中间体2（0.5g，0.0012mol）于有冷凝装置的100mL茄形瓶中，加入10mL四氢呋喃作溶剂，使其溶解后滴加浓盐酸0.5mL，70℃下回流30min。等待反应结束后，先旋干溶剂，后加水洗涤抽滤得固体，烘干得0.3g，产率为75.9%。

D.目标产物4的合成

取中间产物3（0.16g，0.005mol）和三乙胺（0.1g，0.001mol）于100mL茄形瓶中，取二氯甲烷20mL溶剂，取（0.15g，0.00056mol）2,4-二硝基苯磺酰氯溶解于少量二氯甲烷中。将溶解后的2,4-二硝基苯磺酰氯在搅拌和冰水浴的条件下滴加于茄形瓶中，室温搅拌3.5～5.5h。反应完毕，先用水猝灭反应，取有机相旋干得固体产物，重结晶后得纯净产物0.18g，产率为65.6%。

目标产物4的核磁表征：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 9.15(d,J=2.2Hz,1H)，9.02(s,1H),8.77(s,1H),8.67(d,J=8.7,2.3Hz,1H),8.36(d,J=8.7Hz,1H),8.25-8.17(m,2H),8.12-8.04(m,4H),7.64-7.58(m,4H),7.48-7.42(m,2H)。

3.结果与讨论

(1)结构表征: 核磁共振氢谱

如图2所示，使用核磁共振氢谱进行表征，确为目标产物。

(2)光谱性质

为了研究探针4对谷胱甘肽的检测是否可行，我们使用紫外分光光度计和荧光分光光度计，分别作了有无谷胱甘肽时的紫外光谱图和荧光光谱图。研究了探针4的光谱性质。研究结果如下所示：

①紫外-可见吸收光谱

如图3所示：取目标探针分子配制浓度为1.0×10-5mol·L-1的溶液，溶剂为二甲基亚砜（DMSO）。测得目标探针分子的紫外吸收光谱，化合物在DMSO溶液中的吸收光谱显示出目标探针分子在391nm处有一个显著的吸收峰。如图4所示，加入浓度为1.0×10-5mol·L-1的谷胱甘肽30μL，此时，吸光度增大，吸收峰蓝移，由原来的391nm蓝移至371nm处，这是由于加入谷胱甘肽后，磺酸酯键断裂，恢复为中间产物3，共轭强度增大。

②荧光发射光谱

取目标探针分子配制浓度为1.0×10-5mol·L-1的溶液，化合物以二甲基亚砜（DMSO）为溶剂、在激发波长为391nm下进行荧光发射光谱的测定。如图5所示，测得探针分子的荧光发射光谱图中的最大吸收波长为472nm。加入浓度为1.0×10-5mol·L-1的谷胱甘肽30μL以后，最大吸收波长由472nm红移至506nm，荧光强度增强，表明探针分子与谷胱甘肽发生了反应，对谷胱甘肽有响应。如图6所示，随着放置时间的增长，分别放置1min、2min、3min以及后续随着时间加长荧光强度继续增强的趋势变化不大，受时间影响程度很小。

发光机制如图7：荧光探针4在加入响应GSH后，得到了中间体3，荧光增强。

4.结论

（1）在相对温和的条件下以9-甲醛为原料且以较高收率合成了一种磺酸脂化合物，通过核磁和质谱等分析手段对此化合物的结构进行了进一步的表征。

（2）实验发现这种新型的磺酸脂在DMSO中具有良好的溶解性，在紫外吸收光谱中发现其具有较好的吸收强度，以此测定其在荧光中的强度。荧光图谱表明该种物质能够与谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸等硫醇小分子发生反应，和这为其今后在荧光探针领域的发展提供了一定的基础。

蒽的衍生物有着相当良好的热稳定性，光化学稳定性。可用作荧光官能团。利用9-蒽甲醛合成此荧光探针具有很多优势，原料便宜易得，合成方法简单温和，而且提纯非常容易，这一类化合物在活体细胞检测中有许多重要的应用。