东营盐碱土壤浸泡水用于螺旋藻的培养研究

＊彭人勇 徐嘉男 刘天中

（1.青岛科技大学环境与安全工程学院 山东 266042 2.中国科学院青岛生物能源与过程研究所 山东 266101）

植物和藻类的生物固碳被认为是减排以CO2为主的温室气体最有效和可持续的途径之一。国内外学者针对微藻固碳展开了一系列的研究[1]。全世界盐碱地存量以及因滥用化肥而土壤盐碱化增量面积共计约10亿公顷，对这些盐碱（化）土壤的改造是一个世界性难题。目前以土工作业为主的物理修复以及添加改良剂的化学修复等压碱降盐方法，均不能从本质上对土壤结构和理化性质进行改善，且成本高、可持续性效果差。利用生物质来提升盐碱土壤中的有机质含量，从而改善其团粒结构、通气、透水性的生物修复与工程与生物修复的结合已成为盐碱土壤的重要趋势。张巍[2]、Singh[3]等均发现固氮蓝藻能够增加土壤孔隙度，降低可交换性Na+含量，增加土壤有机质。螺旋藻具有生长迅速、有机质含量高[4]，能够适应多种复杂环境（如污水）等优点，因此利用大水浸泡压碱排盐的盐碱地改造工程中的盐碱浸泡水进行螺旋藻的培养，既可以实现CO2的固定[5]，又可以为盐碱土壤提供丰富的有机质，有助于形成盐碱地改良的长效机制。东营盐碱地土壤含有大量的Cl-、Na+、SO42-，而植物生长所需的N、P、K等营养离子却极度贫乏。目前对其采取的水利工程措施（如深耕、埋暗管）、化学措施（如脱硫石膏）、生物措施（如耐盐碱植物的培养）等改良方法，改良周期较长且易反盐。本研究拟利用东营盐碱土壤浸泡水来培养螺旋藻，探讨螺旋藻在盐碱土壤浸泡水的生长特性及对生化组分进行分析，以确定最佳培养条件，提高生长固碳效率，从而为未来建立在盐碱地大水漫灌土工作业时利用盐碱浸泡水的螺旋藻培养固碳—有机质提升的土壤改造技术奠定基础。

1.材料与方法

(1)藻种与培养基

实验所用螺旋藻藻种（Spirulina platensis）来自中国科学院青岛生物能源与过程研究所。其基础培养基为Zarrouk培养基（g/L）：NaNO32.5，K2HPO40.5，K2SO41，NaCl 1，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.01，Na2-EDTA 0.08，NaHCO316.8，1mlA5溶液[H2BO32.86，MnCl2·4H2O 1.8，ZnSO4·7H2O 0.222，Na2MoO40.39，CuSO4·5H2O 0.079，Co(NO3)2·6H2O 0.049。

(2)盐碱土及其浸泡水

实验用盐碱土取自山东省东营市东营区东七路与南二路交叉口（37°24′15.0″N，118°44′10.0″E），取土深度0～10cm，盐碱土经充分混合、风干、研磨、过筛后备用。利用蒸馏水按照5:1的水土比浸泡该盐碱土，机械搅拌使其充分混匀后，过滤保存备用。

(3)培养实验条件和方法

螺旋藻的培养在柱式玻璃光生物反应器中进行。反应器直径为3cm，高70cm，每次装液量为300mL。培养以日光灯为光源，光照强度为100μmol·m-2·s-1，实验室培养温度控制在24±1℃，并依实验条件通入含不同体积分数的CO2的混合空气。

①氮源质量浓度的影响：以1.2获得的浸泡水为水源按Zarrouk培养基的组成要求进行培养基配制，其中作为氮源的NaNO3设置了4个质量浓度梯度：0.625g/L，1.25g/L，1.875g/L，2.5g/L。

②磷源质量浓度的影响：同上，作为磷源的K2HPO4设置了4个质量浓度梯度：1.343g/L，0.671g/L，0.500g/L，0.336g/L。

③光照强度的影响：实验中设置了6 个光强：即20μmol·m-2·s-1，50μmol·m-2·s-1，90μmol·m-2·s-1，120μmol·m-2·s-1，150μmol·m-2·s-1，200μmol·m-2·s-1。

④光照周期设置了3个光照周期（L/D）：10:14，14:10，24:0。

⑤无机碳源的影响：利用CO2替代NaHCO3，通气量为0.2vvm，设置了5个CO2（v/v）体积分数梯度，即0.038%（空气），1%，2%，3%，5%。

⑥简易培养基对螺旋藻培养的影响：以1.2获得的浸泡水为水源，只添加氮和磷元素，并设置不同的质量浓度：A.添加0.500g/L K2HPO4，改变NaNO3质量浓度：0.75g/L，1g/L，1.25g/L，1.5g/L，1.75g/L，2.5g/L；B.添加2.5g/L NaNO3，改变K2HPO4质量浓度：0.671g/L，0.500g/L，0.448g/L，0.395g/L，0.336g/L。

(4)分析方法

①生物量的测定

吸取5ml（V）的藻液，抽滤至事先称重过的醋酸硝酸纤维素膜（W0），并用3倍的去离子水冲洗3次，去掉附着在细胞表面的营养盐分，置于105℃烘箱中烘干至恒重后再次称重（W1），生物量计算方法为W0=(W1-W0)/V[6]。

②固碳速率计算

CO2固定速率计算公式如下：CO2的最终固碳速率（Rc）与生长率（Px）和干藻细胞含碳量（Ce）有关，

其中，X1和X2分别为t1和t2天的生物量；Ce为干藻细胞含碳量，通常藻细胞中分子量为CO0.48H1.83N0.11P0.01；Mco2为CO2的相对分子质量；Mc是C的相对原子质量。

③生化组成分析

藻液离心后收集藻细胞，利用冷冻干燥机冻干后，称取一定量的干燥藻粉，加入石英砂，充分研磨后，利用元素分析仪[7]进行氮元素的测定，采用苯酚-硫酸法测定藻细胞中多糖含量。

④培养基中NaNO3-N和K2HPO4-P质量浓度的测定

NaNO3-N的测定：新鲜藻液离心后去数毫升上清液，置于石英比色皿中，利用紫外分光光度计测量；K2HPO4-P的测定：参考《中华人民共和国国家标准GB11894-89水质总磷的测定钼酸铵分光光度法》。

⑤盐碱土壤可溶性盐含量的测定

取处理后土壤与蒸馏水按照1:5的比例混合，充分震荡混合3min后过滤，取滤液利用离子色谱进行测定；碳酸根和碳酸氢根含量利用双指示剂滴定法进行测定；土壤pH值利用pH计进行测定。

2.结果与分析

(1)土壤可溶性盐含量测定

盐碱土壤浸泡液可溶性盐含量如表1所示。土壤中含有大量的C l-和Na+，总量达到土壤可溶性盐含量的91.3%，NH4+和HCO3-含量较低，但K+、Mg2+、Ca2+等离子较丰富，未检测出磷元素和CO32-含量。比较螺旋藻生长的Zarrouk培养基组成可知，要用浸泡水来培养螺旋藻，必须加入必要质量浓度的氮源和磷源。

表1 盐碱土壤可溶性盐含量的测定（c/mg·L-1)

(2)氮源和磷源质量浓度对螺旋藻生长的影响

图1为在不同培养条件下连续培养15d时，螺旋藻的生物量变化。实验结果表明：氮质量浓度为2.5g/L时，最高生物量可达14.36g/L（图1-a）；磷质量浓度过高或过低均不利于螺旋藻的生长，0.5g/L为其最适磷质量浓度，此时螺旋藻所能达到的最大生物量为12.49g/L，明显高于其他实验组（图1-b）；虽然盐碱土浸泡水中Na+和Cl-质量浓度较高，对螺旋藻细胞的生长影响不明显，表明螺旋藻能够耐受较高质量浓度的盐分。

(3)光照条件对螺旋藻生长的影响

不同光照强度条件下螺旋藻的生长情况如图2（a）。随着光照强度的增加，螺旋藻的生长速度加快，在120μmol·m-2·s-1时生物量最大，达到11.68g/L，但当光强大于120μmol·m-2·s-1后，螺旋藻的生长会受到光抑制，这与Converti A等[8]的研究结果相一致，表明120μmol·m-2·s-1左右的光强是螺旋藻生长的饱和光强。按照夏季和冬季不同的昼夜时长，本研究选择光/暗比分别为10:14和14:10，以24h光照为参照时进行螺旋藻培养，结果如图2（b）所示。在24h光照条件下螺旋藻生物量最高，达到10.95g/L；相比全光照，光暗的交替使螺旋藻生物量的积累变慢，且这一趋势随着光照时间的减少而愈加明显。在后期实验中，采用光强为120μmol·m-2·s-1、24h光照的条件进行培养。

(4)螺旋藻对CO2的利用

Zarrouk培养基中含有大量的NaHCO3，一方面用来为螺旋藻的生长提供碳源，另一方面调节培养基的pH值，使之能够在适宜的碱性条件下正常良好地生长。除了NaHCO3，也可以利用CO2作为碳源培养螺旋藻，这样既可减少无机盐的使用，又有利于实现CO2的固定。本研究考察了在不添加NaHCO3的情况下，不同体积分数的CO2气体对螺旋藻生长的影响。如图3（a）所示，当CO2体积分数由对照的0.038%（空气）增长到3%，生物量迅速增加。当CO2体积分数超过3%时，生物量降低，这表明本实验中，3%是最佳的CO2体积分数。

通入不同体积分数CO2下螺旋藻的CO2固定速度变化如图3（b）所示。与对照的通入空气相比，3% CO2(v/v)体积分数下螺旋藻的生长达到最大值，对应的固碳速率也达到最大值，为2.21g·L-1·d-1，继续升高CO2体积分数，螺旋藻固碳速率降低。

(5)简易培养基培养螺旋藻

前述结果表明盐碱土壤浸泡水来配置Zarrouk培养基可以很好地用于螺旋藻培养。但Zarrouk培养基中除氮磷外的全微量元素的加入是不经济的。因此基于成本考量，本研究进一步考察了直接用盐碱土壤浸泡水适当添加氮、磷元素和通入体积分数为3% CO2（v/v）配置简易培养基中螺旋藻的生长情况。

在加入0.5g/L K2HPO4和不同质量浓度的NaNO3下的简易培养基中螺旋藻的生长情况如图4（a）所示。NaNO3质量浓度从0.75g/L升高到2.5g/L时，培养8d后螺旋藻细胞质量浓度约为6.5～7.5g/L，与图1（a）的Zarrouk全培养基下螺旋藻的生长差别不大，表明盐碱土壤浸泡水中的微量营养元素能够满足螺旋藻生长所需。氮质量浓度的高低对螺旋藻的生长速率影响不大。

土壤浸泡水中加入不同初始质量浓度NaNO3的简易培养基培养螺旋藻过程中培养基氮质量浓度的变化如图4（b）所示。从图4（b）中可以看出，随着培养过程的进行，培养基中的氮源逐渐被消耗。不同初始氮源质量浓度的简易培养基中氮源的消耗速率基本相同，只是当初始氮源质量浓度较低时，如初始NaNO3质量浓度分别是为0.75g/L、1.0g/L、1.25g/L，1.5g/L和1.75g/L时，培养基中的氮源分别是在2d、3d、4d、5d和6d就基本上就被螺旋藻细胞完全吸收。但比较图4（a），即使培养基中氮源在被消耗完全后，细胞的生长仍然没有停止。这可能与螺旋藻的生化组成特性相关。不同于其他微藻，螺旋藻细胞的主要组成部分是蛋白质，其从培养基中的高效摄取的无机氮主要用于蛋白质的合成。当外界环境中氮源不足时，蛋白质的继续积累虽然受限，但螺旋藻能够分解利用自身合成蛋白质继续供给细胞固定CO2合成有机碳等骨架分子继续生长。从表2所示不同初始NaNO3质量浓度下培养获得的螺旋藻细胞的蛋白质和多糖组成可以看出，当培养基初始氮质量源浓度较低时，螺旋藻细胞中的蛋白质含量较低，只有18%～25%，而作为诸能物质的多糖等碳水化合物受氮胁迫诱导，含量较高，可达20%～30%。而当培养基中氮源充足时，如NaNO3为2.5g/L时，其8d培养终点的螺旋藻细胞中蛋白含量最高，可达47%左右，这个时候细胞的多糖含量却只有16%左右。这与Madkour[9]所报道结果相一致。培养基成分的改变导致藻细胞中生化组分发生变化。

表2 不同NaNO3质量浓度培养螺旋藻中蛋白质和多糖的含量分析

同样，在加入0.75g/L NaNO3及不同质量浓度的K2HPO4下的简易培养基中螺旋藻的生长情况如图5（a）所示。类似地，K2HPO4质量浓度从0.336g/L升高到0.671g/L时，培养8d后螺旋藻细胞质量浓度约为5～6g/L，与图1（b）的Zarrouk全培养基下螺旋藻的生长相比，差别不大。初始磷质量浓度的高低对螺旋藻生长速率的影响也不明显。

上述这一结果表明，只要在盐碱土壤浸泡水中加入适量的氮和磷源，盐碱土壤浸泡水中的微量营养元素能够满足螺旋藻生长所需。

土壤浸泡水中加入不同初始质量浓度K2HPO4的简易培养基培养螺旋藻过程中培养基磷质量浓度的变化如图5（b）所示。从图中可以看出，与图4（b）中氮的消耗类似，随着培养过程的进行，培养基中的磷源在培养前期均快速被消耗。K2HPO4质量浓度较低时（0.336g/L和0.395g/L），培养第二天磷的吸收率就达到92%以上。随着初始磷质量浓度的增大，磷源的完全吸收时间延长，如当K2HPO4质量浓度为0.671g/L时，培养基中的磷源在第5天才被完全吸收。相较于氮元素，同大多数微藻一样，螺旋藻在生长初期对于磷源的吸收速度更快。与图5（a）相似，即使在培养基中磷源被消耗吸收后，细胞的生长仍在继续。有研究发现，微藻吸收的无机磷酸盐能够以多磷酸盐的形式储存在藻细胞的多磷酸盐颗粒中，当培养基中磷源缺少时，这些颗粒就会消失，释放出磷源供细胞生长。从表3可以看出，与氮源对微藻细胞组成的影响不同，不同初始K2HPO4质量浓度下螺旋藻细胞中的蛋白质及多糖含量的变化不大，蛋白质含量在40%～46%之间，多糖含量在11%～16%之间，这与正常培养基NaNO32.5g/L，K2HPO40.5g/L条件下螺旋藻中蛋白质与多糖含量相差不大，由此推断出磷元素对螺旋藻细胞生物量及生化组分变化的影响弱于氮元素对藻细胞的影响。

表3 不同初始K2HPO4质量浓度的简易培养基中培养螺旋藻的蛋白质和多糖含量

3.结论

利用东营盐碱土壤浸泡水培养螺旋藻，考察了不同氮源和磷源质量浓度的盐碱土壤浸泡水Zarrouk培养基、光照条件、通气二氧化碳质量浓度等对螺旋藻生长的影响，结果表明，利用表明盐碱土壤浸泡水的Zarrouk培养基完全可用于螺旋藻的培养。在此基础上考察了土壤浸泡水中只加入氮源和磷源和简易培养基对螺旋藻培养的影响，表明该简易培养基培养螺旋藻的效果与Zarrouk全培养基无明显差别。培养基质量氮源浓度和磷源质量浓度对螺旋藻生长影响不大，但低氮源质量浓度下抑制了螺旋藻蛋白质的合成，促进了细胞多糖的合成。东营盐碱土壤浸泡水加入2.5g/L的NaNO3和0.50g/L的K2HPO4，可以支撑螺旋藻的快速生长。研究结果为未来建立在盐碱地大水漫灌土工作业改造时利用盐碱浸泡水培养螺旋藻来实现固碳—有机质提升的土壤改造技术奠定了基础。