非小细胞肺癌组织中miR-888-3p表达变化及对预后的预测作用

窦光华，杨锦雷，张 伟

(合肥市第一人民医院，安徽 合肥 230001)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是临床常见的恶性肿瘤，约占肺癌总数的80%～85%[1-2].临床上，NSCLC主要根据临床分期情况对其进行不同方法的治疗，Ⅰ、Ⅱ、ⅢA期主要以手术切除为主，NSCLC早期临床症状不典型，甚至缺乏特异性的症状及体征，早期不易确诊，大部分患者在初次确诊时已进展为局部晚期或晚期，错过了最佳手术时机，预后较差且易复发[3-4].miRNA是基因转录后表达的重要调控因子，参与调控细胞增殖、分化、转移、侵袭和凋亡，有研究[5]表明：食管鳞状细胞癌中miR-888-3p高表达，抑制其表达可以上调凋亡相关基因(PDCD5)的表达水平，激活p53依赖的凋亡信号转导途径，抑制细胞增殖.目前，关于NSCLC与miR-888-3p的相关报道较少，本研究通过检测癌组织与癌旁正常肺组织中miR-888-3p表达水平，以探讨其对NSCLC患者预后情况的预测价值.

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年3月—2016年5月合肥市第一人民医院收治的NSCLC患者140例，男87例，女53例，年龄42～78岁，平均(61.15±6.55)岁，其中吸烟者95例.组织类型：腺癌72例，鳞癌68例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期65例，Ⅲ期75；浸润深度(T分期)：T1～T2 85例，T3～T4 55例；组织分化程度：低分化72例，中/高分化68例；淋巴结转移50例；手术方式：肺叶切除113例，单侧全肺切除27例.收集手术切除后的癌组织以及癌旁正常肺组织(距肿瘤边缘>5 cm).本研究经合肥市第一人民医院医学伦理委员会批准，患者均知情同意.

纳入标准：符合NSCLC诊断，初次诊断；手术前未行任何抗肿瘤治疗；TNM分期(IASLC第七版)Ⅰ～Ⅲ期；年龄>18岁；ECOG评分0～2分.

排除标准：合并其他肿瘤或心、脑、肾等重要器官严重疾病者；妊娠期或哺乳期患者；临床病理资料不全者.

1.2 研究方法

1.2.1 组织样本采集

采集所有患者癌组织及其配对的癌旁正常肺组织于-80 ℃冰箱中保存.

1.2.2 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)法检测组织miR-888-3p的表达水平

采用TRIzol试剂(上海杰美基因医药科技有限公司)提取总RNA，以Nanodrop 2000超微量分光光度计(上海剑凌信息科技有限公司)测定总RNA浓度，并按照反转录试剂盒(Thermo Fisher Scientif公司，美国)说明书将总RNA反转录成cDNA.对miR-888-3p进行扩增，反应条件95 ℃，预变性90 s；95 ℃，变性15 s；60 ℃，退火30 s；72 ℃，延伸20 s；40个循环.以U6作为内参，采用2-ΔΔCt法分析癌组织及癌旁正常肺组织中miR-888-3p的表达水平.miR-888-3p、U6引物序列由德国Qiagen公司构建.引物序列见表1.

表1 引物序列

1.2.3 随 访

治疗结束后，通过电话询问、门诊复查的方式对NSCLC患者在5 a内进行随访，记录患者治疗后生存时间.随访终点为患者死亡或截至2021年5月.

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 不同组织中miR-888-3p表达水平

通过TCGA(https：∥portal.gdc.cancer.gov/)LUAD(肺腺癌)项目中下载lmiRNAseq数据，使用ggplot2包进行统计并作图，结果显示，miR-888-3p在NSCLC组织中的表达水平高于癌旁正常肺组织.见图1.本研究检测miR-888-3p的相对表达量，NSCLC组织miR-888-3p相对表达量明显高于癌旁正常肺组织(P<0.05).见表2.

图1 miR-888-3p在NSCLC组织和癌旁正常肺组织中的表达

表2 NSCLC组织和癌旁正常肺组织miR-888-3p表达水平

2.2 NSCLC组织中miR-888-3p表达与患者临床病理参数的关系

miR-888-3p表达水平与患者年龄、性别和吸烟、组织类型、手术方式无明显关系(P>0.05)，而与肿瘤的分化程度和浸润深度、淋巴结转移、TNM分期明显有关(P<0.05).见表3.

表3 NNSCLC组织中miR-888-3p表达与患者临床病理参数的关系

2.3 miR-888-3p靶基因的鉴定

通过生物信息学数据库(mirtarbase、starbase、mirDIP数据库)对miR-888-3p靶基因数据求交集，3个数据库中预测55个靶基因与这些预测算法的结果重叠.见图2.

图2 miR-888-3p靶基因的鉴定

2.4 miR-888-3p共表达基因的GO富集分析

应用Enrichr网站将上述55个靶基因做通路富集分析时发现，其主要富集于长时程增强、雌激素信号通路、肾细胞癌、趋化因子信号通路、GnRH信号通路、癌症中的蛋白多糖、孕酮介导的卵母细胞成熟、脂质和动脉粥样硬化、RAS信号通路、化学致癌等.见图3.

图3 miR-888-3p及其共表达基因的GO富集分析结果

2.5 NSCLC患者中miR-888-3p高表达与低表达的生存分析

miR-888-3p低表达者与高表达者5 a总体生存率分别为83.5%(117/140)、57.4%(38/140)，miR-888-3p低表达者5 a总体生存率明显高于高表达者(χ2=90.193，P<0.05).见图4.

图4 miR-888-3p低表达组与高表达组NSCLC患者的生存曲线

2.6 COX回归分析NSCLC患者预后不良的危险因素

单因素COX分析表明：性别、吸烟、分化程度、淋巴结转移、TNM分期、miR-888-3p水平均是影响NSCLC患者预后的危险因素(P<0.05)；多因素COX分析表明，TNM分期、癌组织中miR-888-3p表达水平是影响NSCLC患者预后不良的危险因素(P<0.05).见表4.

表4 COX回归分析NSCLC患者预后不良的危险因素

3 讨 论

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是现阶段全球范围内肿瘤相关死亡的主要原因之一，美国癌症学会最新数据[6]显示，全球每年约163.89万人因癌症致死，其中，约22.61万人为肺癌.近年来，靶向与免疫治疗已成为NSCLC治疗的趋势，对延长肺癌患者的生存时间及改善生活质量有明显帮助，但由于个体差异性，患者预后存在明显不同，因此，仍需要继续寻找能辅助评估患者近远期预后的实验室指标[7-8].

NSCLC的发生受多种基因的调控，目前其发病机制尚不明了，虽然大多诊断技术和治疗措施应用到临床，但NSCLC患者整体60个月生存率仍较低[9].因此，从基因方面深入了解NSCLC，可能对病情评估及完善治疗方案有积极意义[10].近年来人们认为，体内、外多种因素相互作用和共同参与从而引发肺癌，既涉及到了肿瘤转移基因、原癌基因和抑癌基因，也涉及到了与肺癌发展特异相关的基因表达异常和功能紊乱，有研究[11]显示，microRNAs可通过调控癌或抑癌基因在肿瘤进展中发挥作用.microRNA为真核细胞内高度保守的内源性非编码单链小分子RNA，长度约为21～25个核苷酸，可稳定存在于外周循环，具有能承受极端pH和温度、不被RNA酶降解等特性.microRNA通过与靶基因的3′端非翻译区进行互补结合，引起靶mRNA抑制翻译或者降解，靶基因转录后表达水平发生改变，能够广泛调控细胞分化、生长、凋亡以及细胞信号转导等，其表达失调与恶性肿瘤等多种疾病密切相关[12].杨颖谕等[1]研究表明，miR-564可能具有抑癌基因作用，在肺癌中表达下调，其表达变化与肿瘤进展和患者预后有关；陈隽[4]研究表明，miR-218低表达与肺癌复发转移具有密切关系，miR-218表达降低，提示肺癌患者预后不良.

miR-888-3p是一种致癌microRNA，是miR-888基因家族一员，在人类多种恶性肿瘤中异常表达.柏莹等[13]研究表明，在结直肠癌组织中，miR-888的表达水平显著高于相应癌旁组织，可作为结直肠癌诊断和预后评估的一个新的潜在标志物.CAO J X等[14]研究显示，miR-888在肺腺癌组织中的表达水平显著高于邻近的非肿瘤组织，且晚期患者(Ⅲ期和Ⅳ期)的miR-888表达水平远高于早期患者(Ⅰ期和Ⅱ期)；miR-888的过表达不仅能够通过靶向细胞分裂周期蛋白7明显抑制肺腺癌细胞的增殖，还可通过靶向E-钙黏蛋白和基质金属蛋白酶组织抑制剂-2促进肺腺癌细胞的迁移和侵袭.另有研究[15]报道，抑制miR-888-5p的表达可增强顺铂对肺癌细胞的抑制作用.本研究中，miR-888-3p在NSCLC组织中的表达明显高于癌旁正常肺组织，与TCGA数据库预测结果一致；另发现3个数据库中预测55个靶基因与这些预测算法的结果重叠，其主要富集于肾细胞癌、癌症中的蛋白多糖、化学致癌等，提示miR-888-3p可能在NSCLC中发挥重要作用.Kaplan-Meier法分析结果显示，miR-888-3p低表达患者具有更高的生存率，且癌组织中miR-888-3p表达水平与NSCLC患者预后不良独立相关，提示miR-888-3p高表达与患者预后不良具有密切的关系，miR-888-3p表达升高可能提示预后不良发生风险高.

综上所述，NSCLC患者miR-888-3p表达升高，与预后不良有关，miR-888-3p可作为NSCLC患者预后评估的一个潜在标志物.但本研究还存在一定的局限性，比如样本量少；只是简单分析miR-888-3p在NSCLC患者癌组织中的表达情况，缺乏其潜在靶基因具体作用机制，有待进一步实验以深入研究miR-888-3p在NSCLC发病过程中发挥的具体作用机制.