肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤新生血管生成的作用及其机制的研究进展△

廉莹莹，孙菲，于静萍#

1大连医科大学研究生院，辽宁 大连 116044

2南京医科大学附属常州第二人民医院放疗科，江苏 常州 213003

近年来的研究表明，肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）可调节肿瘤的发生、发展和血管生成等，且TAM受肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）的影响，在各种肿瘤中广泛存在[1]。虽然传统观点认为巨噬细胞是固有免疫细胞，其作用是促进炎症反应从而抑制肿瘤生长，但是越来越多的实验和临床证据表明TAM通过刺激血管生成、抑制抗肿瘤免疫和组织重塑等促进肿瘤的生长、侵袭和转移，参与肿瘤的免疫抑制，且肿瘤的恶性程度与TAM的数量呈正相关[2]。研究表明，在多种妇科肿瘤[3]、肺癌[4]、胃癌[5]和食管癌[6]等恶性肿瘤中高度浸润的TAM与患者的不良预后密切相关。由于这些特性，TAM被认为是治疗恶性肿瘤的潜在靶点。TAM可通过分泌多种促血管生成因子促进血管生成，例如血管内皮 生长 因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、成纤维细胞生长因子 2（fibroblast growth factor 2，FGF2）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），而血管新生的能力取决于这些生长因子的表达水平和血管密度[1,7]。活化的M2型巨噬细胞被认为是TAM，主要由辅助性T细胞（helper T cell，Th）2或肿瘤细胞释放的白细胞介素（interleukin，IL）-4和IL-13刺激而极化，通过分泌多种细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等，参与血管生成、组织重塑与修复、免疫抑制[7]。因此，阻断TME中TAM的活化或再极化是治疗肿瘤的新策略。本文对TAM的来源、作用、极化和促进肿瘤新生血管生成的主要机制及其在肿瘤治疗中的价值进行综述。

1 TAM的分型与极化

巨噬细胞作为一种免疫细胞，具有多种功能，包括防御病原体、促进炎症反应和抑制肿瘤生长等。TAM是指浸润在肿瘤组织或存在于TME中的巨噬细胞，主要来源于血液中的单核细胞和胚胎时期卵黄囊组织[1]。TAM由巨噬细胞分化而来，根据巨噬细胞活化的状态、发挥的功能以及分泌的因子不同，分为经典活化的M1型巨噬细胞和交替活化的M2型巨噬细胞，它们具有很强的可塑性，当局部微环境改变时，M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞可以相互转化。其中M2型巨噬细胞被认为是TAM，参与肿瘤细胞的侵袭、转移，并促进血管生成[8]。

M1型巨噬细胞为单核巨噬细胞受γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的刺激分化而成，M1型巨噬细胞可分泌促炎因子IL-12和IL-23，从而促进T细胞极化为Th1细胞。活化的T细胞可以杀死病原微生物和肿瘤细胞，M1型巨噬细胞能够分泌大量的活性氧中间体（reactive oxygen intermediate，ROI），具有很强的抗原呈递能力。M2型巨噬细胞可表达大量的清道夫受体，这与IL-10、IL-1β、VEGF的高表达有关。M2型巨噬细胞可以被IL-4激活，在寄生虫清除和组织修复中发挥重要作用，能够将T细胞极化为Th2细胞，并抑制免疫反应[8]。因局部细菌产物和IFN-γ等M1型极化信号不足，但M2型极化信号增多，导致TAM与M2型巨噬细胞的功能表型相似。因此，不能仅把巨噬细胞简单分为M1型和M2型，为了能更好地反映其在体内的情况，M2型巨噬细胞被细分为M2a型、M2b型、M2c型、M2d型[9]。巨噬细胞不仅具有多样性，还具有很强的可塑性。根据局部微环境中信号的不同，巨噬细胞的表型可以发生动态改变。已有研究表明，通过细胞因子的作用，完全极化的M1型和M2型巨噬细胞可转变为相反的功能表型[10]。

2 TAM与肿瘤新生血管的关系

TAM在肿瘤发生和发展中具有重要作用，并在血管生成中发挥重要作用。1971年，Judah Folkman提出肿瘤生长依赖于血管生成，即从已存在的毛细血管中萌发出新的血管，它对氧气和营养物的供应和清除都至关重要，从而促进肿瘤的生长、增殖、侵袭和转移[11]。Zeisberger等[12]应用氯磷酸盐脂质体特异性清除巨噬细胞，可明显抑制肿瘤的生长和血管生成。由此可见，TAM参与肿瘤的血管生成，并发挥重要作用。

TAM通过分泌多种促血管生成因子来促进血管生成，如 VEGF、PDGF、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1β、IL-8、C-C趋化因子配体2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）、C-X-C趋化因子配体8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8）和C-X-C趋化因子配体12（C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12）等，而血管新生的能力取决于这些生长因子的数量和血管密度，微血管密度与TAM的密度密切相关。研究表明，TAM可以通过促进基质形成和释放PDGF来促进血管生成。TAM分泌的血管生成因子胸苷磷酸化酶能够促进内皮细胞迁移，参与血管生成过程，其表达水平与肿瘤新生血管生成有关[1,8]。TAM同时还能够分泌有助于血管生成的酶，如MMP2、MMP7、MMP9、MMP12和环氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2）。此外，TAM能够通过纤维蛋白沉积促进凝血活性，从而间接促进血管生成[13]。

由于肿瘤细胞代谢旺盛，生长迅速，但脉管系统发育不良，导致缺氧是大多数实体瘤的常见特征。缺氧是TME的标志之一，为了帮助肿瘤细胞克服营养缺乏，并将TME转变为更适合肿瘤细胞生存的环境，细胞通过许多基因的转录来感知和平衡低氧水平[14]。肿瘤缺氧区TAM偏好停留于缺氧部位，缺氧能够诱导缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）的分泌，增强肿瘤细胞的促血管生成能力。肿瘤缺氧区TAM与VEGFA表达增加密切相关[15]。HIF由HIF-1α、HIF-2α和HIF-1β组成。在常氧条件下，HIF-1靶基因被关闭，脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase，PHD）可以检测细胞中的氧含量，通过脯氨酸残基上的HIF-1α亚基羟基化来应答氧的存在，HIF-1α在脯氨酸402和531残基上产生结合位点，HIF-2α在脯氨酸405和531残基上产生结合位点，促进与肿瘤抑制因子von Hippel-Lindau（VHL）结合，介导HIF-1α的泛素化和蛋白酶降解[16-17]。缺氧条件下，TAM开始大量表达HIF等转录因子，由于PHD活性受损，对HIF-1α的脯氨酸羟基化作用减弱，HIF-1α的降解被阻断。非羟基化的HIF-1α比羟基化的HIF-1α更稳定，导致蛋白质表达增加，该蛋白质随后可与HIF-1β相互作用并促进HIF-1靶基因转录，通过激活血管生成因子VEGF的转录促进血管生成，从而增加肿瘤细胞的侵袭能力[15]。神经纤毛蛋白1（neuropilin 1，NRP1）是信号素 3A（semaphorin 3A，SEMA3A）的受体，低氧时与TAM的信号应答相关，若敲除NRP1，可恢复抗肿瘤免疫并抑制血管生成。一旦巨噬细胞进入缺氧部位，NRP1在TAM中的表达下调，导致TAM再分布减少，抑制肿瘤生长，减少血管生成[18]。

Badawi等[19]研究发现，在结肠癌中，恶性/侵袭性肿瘤的TAM浸润数明显高于良性息肉，从而增加了血管密度。由此可见，TAM的浸润与结肠癌细胞的血管生成密切相关，并且与血管密度呈正相关。同样的现象在口腔鳞状细胞癌[20]、胃癌[21]、乳腺癌[22]和胰腺神经内分泌肿瘤[23]中也有报道。

3 TAM与抗血管生成治疗的关系

在肿瘤的发生和发展过程中，血管生成发挥至关重要的作用。越来越多的研究者针对抗血管生成治疗进行研究。此外，TAM能够促进肿瘤侵袭、转移和血管生成。因此，TAM与肿瘤的抗血管生成治疗密切相关。目前已有的策略包括阻断巨噬细胞募集、TAM重编程和靶向TAM释放促血管生成因子等。因此，靶向TAM是一种具有前景的肿瘤治疗策略。

3.1 阻断巨噬细胞的募集

3.1.1 C-C趋化因子受体 2（C-C motif chemokine receptor 2，CCR 2）抑制剂近年来，通过抑制巨噬细胞的募集来消除TAM已成为一种新的抗肿瘤治疗策略。CCL2、CCR2是巨噬细胞募集的重要参与者，阻断CCL2/CCR2信号通路可明显减少肿瘤中的TAM，从而抑制肿瘤的生长、侵袭、转移和血管生成。Teng等[24]研究发现，在肝癌小鼠模型中，可以通过敲除CCR2或应用CCR2拮抗剂来抑制炎性单核细胞的募集、TAM的浸润和极化，从而抑制肿瘤生长并延长肝癌小鼠的存活时间。此外，类似的CCR2抑制剂，如CCX872-B、BMS-813160、PF-04136309和MLN1202在小鼠模型中也显示出疗效，目前已进入临床试验阶段[25]。但需要注意的是一项基于乳腺癌模型的研究表明，停止CCL2/CCR2信号通路的阻断可能会加重肿瘤的进展和转移，从而加重病情[26]。

3.1.2 集落刺激因子 1受体（colony stimulating factor 1 receptor，CSF 1 R）抑制剂集落刺激因子1（colony stimulating factor 1，CSF1）/CSF1R 信号通路也是巨噬细胞存活、募集、分化的重要参与者。TAM通过分泌CSF1刺激巨噬细胞在肿瘤内聚集和移动，CSF1与其受体CSF1R结合后，能够促进人单核细胞存活和向巨噬细胞分化，增加TAM的浸润，促进肿瘤的生长、侵袭、转移和血管生成[27]。目前已研制出一些CSF1R抑制剂，如Pexidartinib（PLX3397）、BLZ945、ARRY-382、PXL7486、JNJ-40346527、IMC-CS4、MCS110、PD-0360324、Cabiralizumab、Emacruzumab和AMG820，正在进行临床试验[28]。

3.2 TAM的重编程

巨噬细胞具有极强的可塑性，当局部微环境或介质改变时，M1型和M2型巨噬细胞可以相互转化。因此，通过阻断TAM极化为M2型巨噬细胞或将M2型巨噬细胞转变为M1型巨噬细胞，可有效地抑制肿瘤进展[8]。Toll样受体（toll like receptor，TLR）作为天然免疫系统中重要的模式识别受体，在抵御病原微生物感染方面发挥着重要作用。据报道，TLR激动剂（如TLR4、TLR7、TLR8和TLR9激动剂等）可通过刺激TAM分化为促炎表型来治疗恶性肿瘤[29]。磷脂酰肌醇-3-羟激酶γ（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase γ，PI3Kγ）被认为是一种TLR信号的内源性抑制因子[30]。因此，激活PI3Kγ可以促进TAM的免疫抑制表型。研究表明，在多种小鼠模型中，PI3Kγ抑制剂可以增加TAM中促炎因子的表达，抑制肿瘤生长，提高小鼠的存活率[31]。这一研究结果为PI3Kγ抑制剂的应用奠定了基础。目前选择性PI3Kγ抑制剂IPI-549正在进行临床试验[32]。

3.3 靶向M 2型巨噬细胞的抗血管生成治疗

目前，抗血管生成已广泛应用于肿瘤的临床治疗中，其机制主要是干扰来自普通血管生成途径的靶分子，但其疗效不一，具有明显的个体差异性，许多抗血管生成疗法的试验结果令人失望，其原因可能是忽略了TAM在血管生成中的重要作用[33]。TAM主要通过分泌促血管生成因子和巨噬细胞与血管的物理作用来促进血管生成[34]。

VEGF是主要的促血管生成因子。Min等[35]使用肿瘤分析法评估针对大肠癌中TAM的抗血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）疗法，结果表明，与正常大肠黏膜组织相比，大肠癌组织中TAM及VEGFR2表达均明显增加，HIF-1α阳性率与TAM中VEGFR2的表达水平密切相关。细胞因子诱导的TAM可通过VEGF/VEGFR2信号通路产生TGF-β1，TAM能够促进血管生成，而抗VEGFR2疗法可能具有控制TAM在大肠癌中免疫抑制功能的治疗潜能，从而提高免疫检查点抑制剂的疗效。M2型巨噬细胞与血管内皮细胞直接接触并相互作用，从而促进血管生成，此过程在一定程度上受血管生成素 2（angiopoietin 2，ANG2）/酪氨酸激酶受体 2（tyrosine kinase receptor 2，TIE2）信号通路的调控[36]。阻断ANG2/TIE2信号通路，可减少肿瘤新生血管生成，抑制肿瘤生长，从而达到治疗肿瘤的目的[37]。上述研究为肿瘤的治疗提供了新思路，对未来的抗血管生成治疗具有重要意义。

4 小结与展望

肿瘤中存在着丰富的TAM，其在肿瘤的生长、侵袭、转移和血管生成等过程中发挥重要作用。同时，TAM受多种复杂因子和分子信号的调节。因此，阻断肿瘤血管生成相关通路、抑制TME中巨噬细胞的招募以及抑制M2型巨噬细胞极化或促进M2型巨噬细胞转变为M1型巨噬细胞是针对TAM的靶向抗肿瘤治疗策略，很多针对TAM的药物正在进行临床试验，并显示出抗肿瘤效果。因此，以TAM为靶点的靶向治疗有望成为抗肿瘤治疗的重要手段。TAM作为肿瘤治疗的潜在靶点，明确其作用可以帮助临床医师确立抗血管生成治疗的目标，也为肿瘤治疗提供新思路。