新型冠状病毒抗体检测及应用

徐婧玥

天津市第五中心医院检验科 天津 300450

自2019年12月，由新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)迅速在全球暴发，是迄今为止全球最大的公共卫生事件。据世界卫生组织报道，截止2022年2月24日，全球新型冠状病毒肺炎感染人数已达4.2亿，死亡人数超过540万，严重威胁人类生命安全。随着德尔塔(Delta)、奥密克戎(Omicron)等变异毒株及无症状感染者的出现，对疾病的早期诊断及疫情防控工作提出着巨大的挑战。目前，COVID-19尚无特效治疗药物，接种新型冠状病毒疫苗被认为是控制感染最有效的方式，但其特异性抗体保护的持久性、人员接种疫苗后产生特异性抗体水平、再次感染中抗体的产生及中和抗体作用机制等问题，仍然存在着一定争议。本文对SARS-CoV-2抗体检测现状及临床应用等情况进行综述，以期为COVID-19预防及诊断提供理论依据。

1 SARS-CoV-2结构

SARS-CoV-2为圆形或椭圆形，直径60-140nm，为单股正链 RNA 包膜病毒。病毒基因组含有3万个碱基、29891个核苷酸，共编码9860个氨基酸，组成29种结构蛋白和非结构蛋白，主要包括核衣壳蛋白(nucleocapsid，N 蛋白)、膜蛋白(membrane protein，M蛋白)、包膜蛋白(envelope protein，E蛋白)和刺突糖蛋白(spike protein，S蛋白)等[1]。棘突糖蛋白由受体结合亚基S1和膜融合亚基S2两个功能不同的亚基组成。该病毒与SARS冠状病毒(SARS-CoV)类似，SARS-CoV-2的S1亚基可识别并与宿主细胞上的血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme2，ACE2)结合，S2亚基上的融合肽可促进病毒与宿主膜的融合，进而感染呼吸道细胞并引起呼吸系统疾病[2]。S蛋白在病毒感染中具有重要的研究价值，Wrapp 等[3]的研究结果表明，ACE2与SARS-CoV-2 的S蛋白结合的亲和力约为SARS-CoV的10～20倍，是SARS-CoV-2水平传播能力较SARS-CoV强的重要原因。此外，已有的研究结果[4-6]提示SARS-CoV-2特异性中和抗体主要是通过竞争性结合SARS-CoV-2 S蛋白的受体结合域(RBD)而发挥中和病毒效应，进而达到有效阻断病毒感染宿主细胞的目的[7]。

2 SARS-CoV-2特异性抗体产生

人类免疫系统产生的抗体通常是病原体入侵机体，机体在抗原物质刺激下，由浆细胞产生一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白，其作用是通过特异性结合抗原，保护人体免受外部物质或生物体的攻击，如毒素、病毒等。根据抗体重链恒定区氨基酸的组成及排列顺序不同共分为五种不同类型，分别为IgA、IgM、IgG、IgD和IgE，在循环中发挥保护作用的主要是IgM 和IgG类抗体。IgM通常于感染后1周左右产生，但半衰期仅为2～3d，其持续时间较短，是反映机体早期感染较好的标志物；IgG常在7～14d产生，半衰期为23～28d，维持时间较长，是感染中后期及既往感染的重要指标[8]。人体在感染SARS-CoV-2后产生抗体的时间及变化规律各研究报道不尽相同。有文献报道[9]感染SARS-CoV-2后大部分患者在2周左右病毒抗体检测阳性。QU等[10]对285例COVID-19患者研究结果提示第一周产生IgM抗体阳性率仅为40%，在12～14d IgM阳性率为95%；刘国才等[11]对483例确诊病例、285例疑似病例进行研究发现，早在发病2d时即有1例患者可同时检测到抗体IgM和IgG ；抗体阳性率最低是在发病1 ～2周内，其IgM和IgG阳性率分别为18.4%、38.8%；在第7～8周可达到峰值，IgM和IgG阳性率分别为33.9%、93.2%；抗体阳性率在第8周后呈现出了下降趋势。徐云云[12]研究显示，COVID-19患者在病程的15～30d内Ig M抗体阳性率最高。罗效梅等[13]收集101例确诊COVID-19患者血液样本，采用胶体金免疫层析法检测特异性抗体提示抗体水平阳性率在发病8d最高，IgM抗体在28d后开始消失，IgG抗体随着病程的延长呈现出了逐渐升高趋势。李闻等[14]对COVID-19患者不同病程时期检测IgM和IgG水平结果显示，IgM抗体水平在病程早期和中期呈现上升趋势，在病程后期呈现逐渐下降趋势；而IgG抗体水平在整个病程中呈逐渐升高趋势，与罗效梅等[13]报道一致；IgG抗体后期I值最高为(9.22±4.62)，与早期I值(0.94±0.7)相比呈现4倍以上升高，其变化规律与机体免疫应答规律一致。不同研究结果出现差异的主要原因与不同类型抗体诊断试剂的敏感性存在差异密切相关，也可能与感染者潜伏期不同有关；进一步对SARS-CoV-2特异性抗体产生变化规律进行研究将为临床诊断及治疗提供重要参考。

3 特异性中和抗体(neutralizing antibodies，NAbs)

病原微生物入侵人体后，B淋巴细胞分化为浆细胞，产生与病原微生物表面抗原相结合的抗体以阻止其感染，这种抗体被称为中和抗体。随着疫苗和小分子药物的研发，针对SARS-CoV-2的中和抗体已被证明是预防和治疗COVID-19的有效手段。SARS-CoV-2通过病毒表面的S跨膜糖蛋白入侵宿主细胞，由于S蛋白在与宿主受体结合及介导膜融合方面起着关键作用，因此它被当作中和抗体的主要靶点。有文献报道[15]S蛋白或RBD的不同区域可以诱导不同的抗体，根据S蛋白表位可以将不同靶蛋白分为五种类型即Ⅰ型-Ⅴ型。Ⅰ型中和抗体作用机制是中和抗体结合在RBD与ACE2之间的结合界面上，从而与ACE2竞争结合RBD，抑制SARS-CoV-2进入细胞，主要包括C105、C102、CB6、B38、CV30等[16]；Ⅱ型中和抗体机制是中和抗体至少需要两个以上的RBD结构，结合在RBD底部的铰链区，该区域在SARS-CoV和SARS-CoV-2之间相对保守；因此，Ⅱ型中和抗体通常可以同时中和SARS-CoV和SARS-CoV-2。由于空间位阻，这些中和抗体需要更特异的结合条件，因此该种抗体类型较少，主要包括CR3022、EY6A、VHH-72等[17]。Ⅲ型中和抗体机制是这些中和抗体只通过重链与一个RBD结合，并与相邻RBD或S1的N端结构域上的糖基化位点相互作用以稳定结合，以防止S蛋白与ACE2结合，从而防止病毒入侵宿主细胞，主要包括Fab2-4、BD23、S2M11、Fab2-43等[18]。Ⅳ型中和抗体作用机制是可以同时靶向两个不同的区域：一个位于受体结合基序(the receptor-binding motif ,RBM)上，另一个位于RBD的一侧与RBM很少或没有重叠，主要包括P2B-2F6、BD-368-2、S2H13等[19]。Ⅴ型中和抗体作用机制为与非RBD结构域作用，即与N端结构域或与膜融合蛋白S2结合，由于与这两个区域结合的抗体不能直接阻断RBD与ACE2的结合，这种抗体可能诱导ADCC或ADCP，防止膜融合所需的构象变化，空间干扰病毒粒子上的ACE2，并通过其他机制发挥作用，主要包括4A8、FC05、FC06、FC07等[20]。不同的中和抗体作用机制不同，其中和病原体的效果也不尽相同。现阶段我国流行的SARS-CoV-2主要变异体为奥密克戎，奥密克戎是在SARS-CoV-2基础上刺突蛋白上有32个位点突变的新变异体[21]。Chen等[22]研究发现SARS-CoV-2奥密克戎变异体的传染性是原病毒的10倍以上，是SARS-CoV-2 德尔塔变异体的两倍。由于奥密克戎具有传染性强、突变位点多等情况，现阶段疫苗有效性评估显得尤为重要，Planas D等[23]在对感染SARS-CoV-2人群及接种疫苗人群血清学研究发现，奥密克戎变异体对所有单克隆抗体的中和作用具有完全或部分抵抗性，加强辉瑞SARS-CoV-2疫苗接种和对有SARS-CoV-2感染史的个体接种，可对奥密克戎变异体产生中和反应，但其抗体滴度比Delta低6～23倍。Nemet I[24]对感染奥密克戎变异体人群研究发现，接种2针剂辉瑞SARS-CoV-2疫苗对奥密克戎变异体未产生中和作用，接种3剂后对奥密克戎变异体的中和效果增加100倍。由此可见，中和抗体的检测对疫苗的接种、有效性评估及药物的研发具有重要的价值。

4 SARS-CoV-2抗体检测技术

抗体自19世纪被发现以来，其在感染性疾病的辅助诊断上得到了广泛应用。常见抗体检测方法主要包括：酶联免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbent assay，ELISA)、免疫印迹法(immunoblot test,IBT)、胶体金免疫层析法(colloidal goldimmunochromatography assay，GICA)、化学发光法(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLIA)及电化学发光法(electroChemiluminescence immunoassay,ECLIA)等。COVID-19疫情在全球蔓延，准确、快速筛查SARS-CoV-2感染人群并进行隔离是阻止疫情传播的有效手段。目前应用的SARS-CoV-2抗体检测技术主要有胶体金法、化学发光法、电化学发光法、酶联免疫吸附法。不同厂家由于包被抗原及实验设计方法不同，其SARS-CoV-2抗体检测敏感性及特异性存在着一定的差异。王远芳等[25]分别采用北京热景生物技术有限公司、广州万孚生物技术有限公司及成都华西精准医学产业技术有限公司生产的GICA法检测试剂盒检测SARS-CoV-2 IgM、IgG及总抗体，结果显示尽管上述三种检测试剂方法学一致，但其诊断效能各不相同。抗干扰因素研究结果表明，类风湿因子对三种试剂干扰较大，显示其假阳性率不一；采用胶体金法检测总抗体或与IgG/IgM抗体联合检测可提高检测结果的特异性。Wan Y[26]等分别对博奥赛斯生物科技有限公司、深圳新产业生物科技有限公司、深圳亚辉龙生物科技有限公司及厦门万泰凯瑞生物科技有限公司生产的化学发光法免疫分析法检测SARS-CoV-2抗体研究中发现，不同试剂盒敏感性和特异性均有所不同，由厦门万泰凯瑞生物科技有限公司生产SARS-CoV-2抗体敏感性为92.00%，特异性为99.23%；深圳新产业生物科技有限公司生产的SARS-CoV-2 IgM抗体敏感性较低，仅为39.55%。Harley K等[27]对雅培化学发光法检测SARS-CoV-2 IgM及IgG与罗氏电化学发光法检测总SARS-CoV-2抗体分析性能评价中提示，雅培IgG和罗氏总抗体检测方法之间的一致性较高，达98.7%，在感染14d后检测一致性为100%；而雅培IgM与罗氏总抗体检测一致性较低，为85.5%。应用雅培和罗氏诊断试剂对1例免疫缺陷COVID-19患者血清抗体检测中发现，在症状出现43d中雅培SARS-CoV-2 IgM、IgG与罗氏电化学发光法检测总SARS-CoV-2 抗体均显示阴性。一项基于核蛋白的ELISA检测SARS-COV-2 IgG抗体试剂盒研发报道，其选取检测COVID-19症状出现15d人群血清中SARS-CoV-2 IgG抗体特异性为97.9%，且与目前常见的引起普通感冒的SARS-CoV如HCoV-229E、-NL63、-OC43和-HKU1感染史个体的血清之间无交叉反应。由于该试剂盒敏感性和特异性高，操作简便，可用于在COVID-19高流行区域内大量疑似病例的特异诊断[28]。SARS-CoV-2抗体检测技术已广泛应用于临床，不同试剂生产厂商基于不同检测原理的SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体诊断阈值不同，其诊断敏感性及特异性也存在着一定的差距，因此，在临床应用前应对不同的试剂盒检测性能进行必要的评估，以确保检测结果的准确，最大程度减少漏诊或误诊。

5 SARS-CoV-2抗体检测临床应用

SARS-CoV-2核酸检测因其敏感性较高，目前被作为实验室诊断COVID-19的“金标准”，但由于该方法学本身存在着一定的局限性，受实验室环境、检测人员及采样等环节影响，同时因检测时间长、操作繁琐，使得大规模人群筛查存在一定的困难，同时也存在着一定的漏诊风险。SARS-CoV-2特异性抗体检测样本类型多为血液样本，具有样本稳定性好、检测方法简便及可批量检测等优点已逐渐被批准应用于临床实验室诊断。国家卫生健康委员会《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》[29]已将新冠抗体检测纳入确诊方案之一。随着SARS-CoV-2疫苗普遍接种，国家卫生健康委在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第九版)》[30]中对SARS-CoV-2抗体的临床应用，依然明确要求对于未接种SARS-CoV-2疫苗者SARS-CoV-2特异性抗体IgG/IgM同时阳性可作为诊断依据。此外，对于既往感染者及SARS-CoV-2疫苗接种者SARS-CoV-2特异性抗体水平评估也是目前研究的热点。德国Hoffmann 等[31]对SRAS-CoV的S蛋白基因研究发现，在感染或疫苗接种过程中针对 SARS-S产生的抗体反应对COVID-19感染者起到一定的保护作用，并且该位点也是预防感染或抗体治疗的一个重要靶点。陈沐等[32]对接种SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)后的COVID-19病例临床特征及抗体情况进行分析指出，接种灭活疫苗后的COVID-19患者在接触SARS-CoV-2后尽管可在短期产生大量IgG抗体，但依然发病；因此，应对SARS-CoV-2疫苗接种后的IgG抗体及再次感染后产生的IgG抗体进行亚类鉴定，并且对这部分患者的病毒基因进行测序，这样可有助于揭示疫苗接种后发生SARS-CoV-2感染的原因。梁咏梅等[33]对181名出院6个月COVID-19患者进行SRAS-CoV-2特异性抗体检测中发现，117名患者IgM抗体阴性、IgG抗体阳性，166名患者可检测到中和抗体；同时发现患者的临床症状严重程度与其体内分泌的中和抗体水平高低呈正相关。Zhao J[34]研究报道RNA检测在发病后7d内敏感性最高，为66.7%；从第8d起抗体检测的敏感性超过了RNA检测，在发病后第12d抗体敏感性达到了90%以上。在晚期患者(发病后第15～39d)的血清样本中，总Ab、IgM和IgG的敏感性分别为100.0%、94.3%和79.8%。进一步分析表明，在发病后第1～3d、第4～7d、第8～14d和第15～39d采集的呼吸道样本中RNA检测为阴性的分别为28.6%(2/7)、53.6%(15/28)、98.2%(56/57)和100%(30/30)。联合使用RNA和抗体检测，显著提高了不同阶段的COVID-19患者诊断的敏感性。血清抗体检测在再感染病例临床研究中显示再感染过程中发现了高亲和力的IgG和高滴度的中和抗体[35]。这表明第一次初次免疫应答启动后，第二次病毒抗原刺激时可以产生更快、更强的体液免疫应答反应。在原发感染期间大部分抗体是非中和性的，中和性抗体水平往往较低。然而原发感染后B细胞成熟并分化为长寿浆细胞或记忆B细胞。在再感染过程中，这些记忆B细胞可以迅速分化为浆母细胞，产生比初次感染时更快的类转换高亲和力抗体。因此建议对于之前未接触过SARS-CoV-2的个体，采用2剂疫苗及加强免疫接种方案能够产生更有效的免疫保护。

综上所述，基于不同原理及生产工艺的SARS-CoV-2特异性抗体检测方法，其诊断敏感性及特异性存在差异；特异性抗体检测在COVID-19诊断、严重程度评估、疫苗接种方案及药用研发上都有重要的临床应用价值。