基于上转换荧光纳米材料免疫层析法快速检测甲硝唑的研究

朱凡君，韦何雯，郭跃平，费建枫

（1.金华市食品药品检验检测研究院，浙江金华 321000；2.杭州纽太生物科技有限公司，浙江杭州 310000）

甲硝唑（Metronidazole，MNZ），又名灭滴灵，属于硝基咪唑类抗生素，能快速杀灭厌氧细菌和抑制感染，在1978年被世界卫生组织定为抗厌氧菌首选药[1]。豆芽在种植、运输和保存过程中，由于保存方法不当，容易导致厌氧细菌繁殖，影响豆芽保质期和品相，因此某些不良商家通过添加甲硝唑等抗生素提高豆芽产量和延长保质期。但硝基咪唑类药物对哺乳动物具有致癌、致畸、致突变作用和遗传毒性，通过食品接触可能会对人们的身体健康构成潜在威胁[2]。国家标准《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）中规定动物源性食品中不得检出甲硝唑[3]。因此，甲硝唑残留量的检测至关重要。目前，精准检测甲硝唑残留的方法主要有高效液相色谱法[4]、液相色谱-质谱联用法[5]，而现场快速检测技术主要有胶体金免疫层析。前两种方法灵敏度高、重复性好、检出限低，但样品前处理烦琐、仪器设备昂贵，对操作人员的要求高，不适用于现场快速检测[1]，后者虽能实现现场快速检测，但该方法多用人眼目测条带显色的有无或深浅进行结果判读，存在人为主观判断误差，且无法定量检测。随着技术发展，相较于胶体金免疫层析技术，近些年出现了可定量检测的免疫层析技术。免疫层析技术根据检测结果能否定量可分为定性检测和定量检测。定性检测主要有胶体金和乳胶免疫层析试纸[6-7]；定量检测主要有时间分辨、量子点和上转换发光免疫层析试纸。镧系上转换发光材料是一类重要的稀土发光材料，利用近红外光作为激发光源，其穿透能力强，能够避免生物样品的自体干扰，从而降低检测背景的干扰，提高信噪比，且发光过程中在材料内部属于物理过程，在此过程中没有衰减或降解，同时检测过程不受液体样品或者采样条件的影响，所以具有较高的稳定性。本研究为解决现有检测技术问题，开发了一种灵敏度高、特异性好、抗干扰性强、可现场检测的甲硝唑上转换发光免疫层析试纸。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白（BSA）、羊抗兔IgG、兔IgG、Tween-20，生工生物工程(上海)股份有限公司；硝酸纤维素膜（NC膜），德国赛多利斯公司；玻璃纤维，购自上海杰一生物技术有限公司；上转换发光纳米材料，杭州胜行生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平，上海豪晟科学仪器有限公司；超声波清洗仪，深圳市洁盟清洗设备有限公司；涡旋混合器，常州越新仪器制造有限公司；DNA混合仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；高速离心机，塞洛捷克公司；荧光免疫分析仪，上海沫亘科技中心。

1.3 实验方法

1.3.1 条件优化

（1）纳米材料标记pH筛选。取3个1.5 mL离心管，编号1、2、3，每管加0.5 mg纳米材料溶液，超声清洗器超声60 s，使纳米材料成为单分散颗粒。在离心力12 000g下，离心10 min去除上清液，加入 1 mL MES 溶液（50 mmol·L-1，pH=6.5），超声重悬。重复一次上述步骤。配制NHS和EDC溶液，加入适量体积于上述重悬溶液中，进行羧基活化，放于DNA旋转混合仪，旋转15 min，离心去除上清液，加入适量纯水，超声重悬。再采用相同步骤离心一次，尽量去除溶液中的NHS和EDC，在离心管1、2、3中分别加入pH值为5、7、9的缓冲溶液，超声重悬。在3个离心管中分别加入适量的甲硝唑抗体，偶联2～4 h或4 ℃过夜。加入适量的封闭剂封闭未结合蛋白的羧基位点，30 min后离心，加入颗粒保存液，超声重悬，重复上次步骤2次，最后得到标记抗体溶液，4 ℃保存待用。

（2）标记纳米材料粒径筛选。取粒径分别为30 nm、60 nm和100 nm的3种纳米材料，分别加入3个1.5 mL离心管，超声清洗器超声60 s，使纳米材料成为单分散颗粒。在离心力12 000g下，离心10 min去除上清液，加入1 mL MES溶液（50 mmol·L-1，pH=6.5），超声重悬。重复一次上述步骤。将适量NHS和EDC加入纳米溶液中，进行羧基的活化，然后放于DNA旋转混合仪中，15 min后离心去除上清液，加入适量纯水，超声重悬。再采用相同步骤离心一次，尽量去除溶液中的NHS和EDC，加入适量缓冲溶液，超声重悬。在离心管1、2、3中分别加入适量的甲硝唑抗体，偶联2～4 h或4 ℃过夜。加入适量的封闭剂封闭未结合蛋白的羧基和非特异性位点，30 min后离心，加入颗粒保存液，超声重悬，重复上次步骤2次，最后得到标记抗体溶液，4 ℃保存待用。

（3）检测线包被浓度确定。检测线用适合的缓冲液将MNZ-BSA终浓度配制成0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1和 2.0 mg·mL-1， 质 控线用适合的缓冲液将羊抗兔IgG配制成终浓度为1.0 mg·mL-1。不同终浓度的检测线和质控线包被到NC膜上，37 ℃烘箱过夜。将标记抗体的复合物喷于结合垫上，与NC膜、吸水纸、样品垫按同一种顺序组成试纸条。用合适的样本稀释液接触层析试纸，借助仪器，观察信号，以阴性样本和阳性样本最大区别为最优条件。

1.3.2 样本处理及标曲制作

（1）样本处理。取20 g具有代表性的豆芽进行捣碎或搅碎，称取5 g样本于50 mL离心管中，加入5 mL甲硝唑提取液，充分摇匀振荡，以3 000 r·min-1离心5 min，上清液即为待测液，备用。

（2）标准曲线制作与数据处理。用豆芽空白提取液配制甲硝唑终浓度为 0 mg·mL-1、0.178 mg·mL-1、0.780 mg·mL-1、3.125 mg·mL-1、12.500 mg·mL-1和50.000 mg·mL-1的溶液，分别取 100 μL 上述溶液与100 μL样本稀释液充分摇匀振荡，低速离心机离心30 s，取100 μL滴加于试纸加样孔上，10 min后检测仪读数，每个浓度测3次。绘制甲硝唑浓度值与T/C信号比值的曲线图。

（3）样本检测。将组装好的免疫层析试纸放于实验台上，取100 μL待测液与100 μL样本稀释液充分摇匀振荡，低速离心机离心30 s，取100 μL滴加于试纸加样孔上，10 min后检测仪读值，测定甲硝唑含量。

1.3.3 试纸成品性能分析

（1）准确性。对阴性样本进行加标，分别配制甲硝唑终浓度为 0 ng·mL-1、2.5 ng·mL-1、5.5 ng·mL-1、和25.0 ng·mL-1的溶液，同一批的试纸检测，每个浓度测5次，通过检测仪读值，计算平均添加回收率和变异系数（Coefficient of Variation，CV）。

（2）批间精密度。取3个批间的大卡，每个大卡切前后3条，共9条，检测同一浓度阳性样本，通过检测仪读值，计算批间平均加标回收率和变异系数。

（3）假阳性率。取豆芽空白样本20份进行预处理，得到待测液，取100 μL待测液与100 μL样本稀释液充分摇匀振荡，低速离心机离心30 s，滴板检测，统计阳性结果，并计算假阳性率。

（4）检测限。根据20次空白样本的结果进行计算，检出限等于20次空白样本平均值加3倍标准偏差。

2 结果与分析

2.1 标记抗体pH值确定

对比不同pH值下标记抗体的检测，检测仪读T，C和T/C值，以阴性样本和阳性样本荧光强度值之差为判断依据，两者差值越大，说明该条件下对阴阳性的区分能力越强。由表1可知，当抗体标记pH值为7时，阴性样本和阳性样本的差值最大。可能是因为抗体的空间结构受缓存液pH值的影响，不同结构下与纳米材料结合的位点不同，从而影响产品最终的性能，因此选择pH=7作为最优条件。

表1 抗体偶联pH值优化

2.2 标记纳米材料粒径确定

对3种不同粒径的上转换发光材料进行扫描电镜表征，结果如图1所示，其中A为30 nm，B为60 nm，C为100 nm。由图2可知，在相同条件下标记同一种抗体，当纳米材料粒径增大时，阴性样本和阳性样本之间的差值也随之变大，因此选择纳米材料粒径为100 nm作为最优条件。

2.3 检测线包被蛋白浓度确定

对比NC膜包被不同浓度抗原的检测结果可知，当包被浓度为1.0 mg·mL-1时，阴性样本和阳性样本之间的差值最大，因此选择包被浓度1.0 mg·mL-1为实验最优条件。结果见表2。

表2 检测线包被浓度优化

2.4 批内精密度、准确性

由表3可知，同一批次试纸检测同一批次豆芽样本中不同甲硝唑加标浓度，免疫层析试纸的加标回收率为90.61%～99.70%，变异系数为3.50%～19.39%，说明该检测方法具有良好的批内精密度及准确性。

表3 空白豆芽样本加标检测结果

2.5 批间精密度、准确性

由表4可知，不同批次的试纸测同一批次豆芽样本，重复3次，免疫层析试纸的添加回收率为92.42%～101.88%，变异系数为11.62%～18.91%，说明该检测方法具有良好的批间精密度及准确性。

表4 不同批次试纸检测豆芽样本加标检测结果

2.6 检测限

试纸条检测空白样本的平均值为0.41 ng·mL-1，根据1.3.3中（4）计算可得该方法的分析检测限为1.01 ng·mL-1。

3 结论与讨论

通过研制上转换发光免疫层析试纸，发现抗体偶联纳米材料时有最适标记的pH值，不同pH值产品的灵敏度不同，原因可能为抗体在不同pH环境中，其空间结构会发生相应变化，导致抗体标记上纳米材料的位点存在差异，所以对抗原抗体的特异性结合也会产生影响。同时，在一定范围内，纳米材料粒径越大，灵敏度越高，阴阳性样本间的差别越大，原因可能为大粒径颗粒比表面积小，偶联效率低，方便层析试纸消线，且大粒径的发光强度比小粒径颗粒强，阴阳性样本间更容易区别；检测线包被蛋白浓度在一定范围内，随包被蛋白浓度增高阴阳性样本间的差别增大，当包被蛋白达到一定浓度时，基本不再变化，原因可能为随着包被蛋白浓度的提高，可以增大抗原抗体间的接触概率，提高抗原抗体间的结合量，但是NC膜结合蛋白的能力有限，达到一定浓度后无法再结合蛋白，所以此时包被蛋白浓度再增加，对于灵敏度的提高基本无影响。

通过对上转换发光材料和免疫层析试纸的研究，结合两者的优点，成功研制了基于上转换发光材料的甲硝唑免疫层析试纸，方法检测限可达1.01 ng·mL-1，加标回收率为90.61%～99.70%，变异系数为3.50%～19.39%，检测时间为10 min。该技术不仅具有免疫层析方便、快捷、成本低的优点，还具有上转换发光材料灵敏度高、抗干扰和抗光漂白等优点，实现了准确性高，重复性好等优点，为大批量样本初筛提供依据。