基于顶空固相微萃取-气相色谱-三重四极杆质谱联用技术的余甘子挥发性成分分析及抗仓储害虫作用研究

黄浩洲 张定堃 李梦琪 谭 鹏 包晓明 莫太刚 樊三虎 韩 丽 林俊芝

(1 成都中医药大学药学院/创新产业研究院,西南特色中药资源国家重点实验室,成都,611137; 2 四川护理职业学院药学系,成都,610100; 3 四川省中医药科学院国家中医药管理局中药质量生物评价重点研究室,成都,610041; 4 岛津企业管理(中国)有限公司,成都,610023; 5 成都市三勒浆药业集团,成都,610000; 6 成都中医药大学附属医院代谢性疾病中医药调控四川省重点实验室,成都,610072)

余甘子PhyllanthusemblicaL.是大戟科叶下珠属热带、亚热带落叶小乔木的果实[1],俗名滇橄榄、油甘子、山油甘、庵摩勒等,是我国西南地区重要的药食同源中药资源与经济作物[2]。余甘子功能润肺化痰,生津止渴,在利咽、降糖、调节血脂代谢、预防牙龈炎等方面治疗和保健作用突出[3]。因此,余甘子在我国藏族、蒙古族、维吾尔族、彝族等16个少数民族中广泛应用,并在全球17个国家的传统药物体系中广泛使用[4],是联合国卫生组织指定全球推广种植的3种保健植物之一。

余甘子气味清香,回味甘甜。其表皮含有一定精油[5],芳香避秽,赋予其独特风味。故余甘子被广泛应用于食品、化妆品和饮料等行业。研究显示,余甘子精油具有较强的抗菌及抗氧化作用[6-7],是上述功能的主要物质载体之一[8]。课题组调查发现,与其他药材形成鲜明比较,余甘子在长期贮藏过程中无任何病虫害现象,推测可能与余甘子独特的气味和挥发性成分有关[8]。通过文献分析发现,在中国和印度,民间常用余甘子退热、驱虫、止泻或杀菌抑菌作用[9],具有一定芳香避秽作用。但目前,关于其抗虫效果及物质基础相关研究未见报道,本文遂对其展开研究。

本研究采用超临界CO2萃取技术对余甘子药材挥发性成分进行萃取富集得到精油,并基于顶空-固相微萃取-气相色谱-三重四极杆质谱联用技术(Headspace Solid Phase Microextraction Gas Chromatography Triple Quadrupole Mass Spectrometry，HS-SPME/GC-QQQ-MS/MS),对余甘子药材及精油成分进行分析。该技术通过建立150多种常见气味成分的多反应监测(Multiple Reaction Monitoring,MRM)定性离子对、母离子质荷比(m/z)、保留时间(Retention Time,RT)及内置标准曲线等关键定性定量数据库,可快速准确地定性定量余甘子的关键气味成分[10]。此外,本文通过气味强度分析建立了气味强度特征谱,可快速分析余甘子挥发性成分气味物质及抗虫作用物质基础。最后,本文以进食率、死亡率和趋避距离为评价指标,对余甘子药材及精油抗仓储害虫的效果进行了评价。通过上述实验,以期为余甘子挥发油物质基础、提取及应用等提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 分析样品 余甘子药材,购于中庸饮片有限公司(四川成都),批号：200601Z。

1.1.2 供试昆虫 供试昆虫为北京清析研究院实验室人工饲养的昆虫。在温度为(26±1)℃,相对湿度55%～75%的养虫室中,用全麦粉∶干酵母粉=20∶1(质量比)混合而成的饲料饲养药材甲、咖啡豆象、米象、印度谷蛾供实验使用。

1.1.3 试剂 苯乙酮，萘，2,6-二氯苯酚和2,4,6-三氯苯甲醚对照品(Sigma公司，美国，批号分别为：48292，40053，40302，47526-U，质量浓度分别为2，5，2，2 μg/mL，)；4-溴氟苯和1,2-二氯苯-d4的混合对照品溶液、苊-d10对照品溶液(o2si公司，美国，批号分别为310239，314514，304594，质量浓度均为100 μg/L)。

1.1.4 仪器 超临界CO2萃取装置(海安华达石油仪器有限公司，型号:SFE230-50-06);三重四极杆气质联用仪(岛津公司，日本，型号：TQ8050)PAL加热磁力搅拌模块和PAL SPME Arrow固相微萃取进样器(思特斯分析仪器有限公司，瑞士，序列号:ARR15-DVB/C-WR-120/20CT,CTC);电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司，型号：XPE26)。

1.2 方法

1.2.1 CO2超临界萃取方法 采用一次加料,一级萃取,一级分离的方法萃取余甘子精油。取余甘子药材粉末(过三号筛),500 g一次性加入萃取罐(1 L),对CO2贮罐进行冷却,设置萃取釜1和萃取釜2的温度为55 ℃和50 ℃,设置分离釜1和分离釜2温度55 ℃和50 ℃,当温度分别达到55 ℃和50 ℃,萃取釜压力27 MPa,当解析罐的压力达到6 MPa时关闭CO2钢瓶,开始循环萃取,调节CO2流量至2.5 mL/min/,恒温恒压萃取3 h,从解析罐中得到余甘子精油[6]。

1.2.2 HS-SPME/GC-QQQ-MS/MS气相色谱条件 采用InertCap Pure-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管柱;进样口温度250 ℃,分流进样,分流比为5∶1,进样口压力为83.5 kPa;高纯氦气作为载气,控制方式为恒压模式;吹扫流量3.0 mL/min;升温程序为:初始温度50 ℃维持5 min,并以10 ℃/min程序升温至250 ℃保持10 min;柱平衡时间为2 min。

1.2.3 质谱条件 离子源为电子轰击源,离子化能量70 eV,离子源温度200 ℃,质谱传输接口温度为250 ℃,碰撞气体为氩气;质谱监测模式为MRM模式,检测器电压相对于调谐结果+0.3 kV,溶剂延迟时间为1.3 min。不同化合物的监测离子对、碰撞电压见表1。为提高检测灵敏度,本实验采用时间分段监测各化合物。

表1 150个化合物定性定量参数和基本信息

1.2.4 顶空-固相微萃取条件 精密吸取余甘子精油(0.1 mL),用研钵与0.5 g淀粉共研磨,使之充分吸附于淀粉上进行稀释,避免过饱和而影响分析准确性。同时,精密称取余甘子药材粉末(过三号筛)0.5 g,将上述精油粉末和药材粉末分别置于惰性顶空瓶内(20 mL),压盖密封,50 ℃平衡40 min。进样前后,固相萃取头被置于270 ℃老化装置中进行老化(3 min),然后插入顶空瓶内,在50 ℃恒温下萃取吸附样品挥发性成分10 min,抽出萃取头并迅速插入已进入预运行状态下的气相色谱-质谱进样口,于250 ℃状态下解吸附(2 min)后进入质谱进行分析。

1.2.5 供试品定性定量检测方法 精密吸取1 μL 4种化合物混标进样分析,评估其系统适用性(取10 mL容量瓶中加入各10 μL的4种标准品溶液,定容摇匀,0.22 μm微孔滤膜过滤即可)。再精密吸取1 μL 3种内标物(0.1 μg/mL)的混标分析,获得内标物峰面积。最后按照上述条件检测样品。所采集数据由岛津TQ8050软件150种化合物的定性离子对数据库进行定性比对,比对后再根据标准曲线结合内标物质的实测峰面积进行定量。

1.2.6 抗虫实验设计 准备3个30 cm×30 cm×30 cm的透明玻璃方格,分别标记为A格B格C格,格内分别放入1 g余甘子药材和虫体各3只,观察其死亡率,进食率和趋避距离。在A格内滴入乙醇1 mL,在B格内滴入余甘子挥发油1 mL,C格内放入余甘子药材,每天观察,趋避距离及进食率在3 h、5 h、7 h进行上述观察。

1.2.7 气味阈值计算 气味阈值是指引起人类气味刺激最小的物质的浓度(pg/mg)。从阈值的定义可以看出,阈值越低,含量越高,则气味越强。浓度与阈值的比值称为气味活度值(Odor Activity Value，OAV):

式中:C代表组分的含量(pg);M代表样品质量(mg);Th代表组分的气味阈值(pg/mg)。一般而言,OAV大于0.1的成分应视为对其气味有贡献的成分。

2.7 数据处理 使用Hiplot(https://hiplot.com.cn)箱图工具进行分析。采用SPSS 22.0工具美国(伊利诺伊州芝加哥市SPSS公司)和Oringin 2018(美国马萨诸塞州汉普顿市OriginLab)进行统计分析。

2 结果

2.1 余甘子药材及精油挥发性成分鉴定结果 根据数据库的定性定量分析,余甘子精油和药材的MRM总离子流图见图1,挥发性成分的检测结果见表2和表3。从图1中可发现,CO2超临界提取富集的成分更多,含量更高。从表2和表3中可知,余甘子药材和精油中分别筛查出70种和58种挥发性化学成分。此外,研究发现,余甘子挥发性成分中多种成分具有特殊香味,如(E)-2-庚烯醛、癸醛、α-松油醇、5-甲基呋喃醛等含量较高的药材和精油共有成分,它们具有一定的芳香味,可能是余甘子风味的物质基础。进一步对挥发性成分进行了定量分析发现,药材和精油中均以乙酸的含量最高,这是其酸味气味的物质基础(图2A,B中最高的峰为乙酸)。但精油中含量略低,可能与超临界提取的物质的极性有关。

表2 余甘子精油化学成分鉴定结果

表3 余甘子药材化学成分鉴定结果

从表2和表3数据中可以发现,精油与药材成分大致相似。其中含量较高的成分以乙酸、乙酸乙酯、正辛醛、(E)-2-庚烯、α-松油醇、5-甲基呋喃醛、己酸、丁酸和丙酸等为主。不难发现,余甘子富含酸类成分,该类成分对昆虫无杀虫作用,但其刺激性气味具有一定的趋避作用。此外,该类物质对于微生物具有较强的抑制作用。

2.2 余甘子气味成分谱与气味强度特征谱 为了更清晰直观地反映余甘子药材和精油中的化学成分含量及气味贡献程度,本文基于其浓度和(OAV,构建了余甘子气味成分谱(Odor Component Spectrum,OCS)和气味强度特征谱(Odor Intensity Characteristic Spectrum,OICS)。在图2中,以150种气味化合物编号为横坐标(化合物名称以表1编号代替),以气味强度为纵坐标,得到余甘子气味强度特征谱。根据2.6中气味阈值的计算得到气味强度,一般认为气味强度大于0.1的成分,表示它能被人体识别并产生气味贡献。通过样品的气味特征谱,可快速地发现对气味变化有关键贡献的化合物,并较为直观、方便地表征其整体气味轮廓差异,分析关键活性成分。

从OCS整体来看,CO2超临界提取富集得到的成分更多,含量更高,主要以萜烯类极性较小的成分为主(76号化合物),而极性较大的成分如乙酸等的富集较药材更少。从图2A和B都可直观展发现,余甘子药材和精油中均含有大量的乙酸。然而在气味特征谱中,由于乙酸等成分的阈值较高,所以对气味的贡献并不十分明显。而一些含量较低的成分反而具有较大的气味贡献,如50和78号成分等。这些微量成分可能是构成余甘子特殊风味的关键。气味阈值是气味成分和气味受体蛋白结合的综合体现。因此,构建气味强度特征谱,进一步明确昆虫气味阈值,对于抗虫气味成分的筛选具有一定意义。

2.3 余甘子药材及精油抗虫作用测定结果 采用死亡率、进食率和趋避作用对余甘子抗虫作用进行研究,结果如图3和图4所示。死亡率结果显示:空白组中药材甲,咖啡豆象,米象,印度谷蛾在实验开始后,未出现死亡现象,死亡出现在最后2 d,死亡率为17%。余甘子精油组中,第3天开始死亡率开始上升到33%左右,第4天后死亡率增加到66%,并趋于稳定,第7天全部死亡。余甘子药材组中随着进食天数的增加,死亡率从第3天开始逐渐增加到17%,第4天25%,第5天58%,第6天75%,最终实验结束后全部死亡。进食率结果显示:空白组中药材甲,咖啡豆象,米象,印度谷蛾的进食率在最开始出现一定的昆虫不进食的现象,以前2个昆虫为主,其余昆虫影响不大。余甘子精油组中,不同昆虫进食率有一定下降,但都在94%以上。余甘子药材组中,进食率呈进一步下降的趋势,但总体在96%以后3个。对以上结果显示,余甘子精油和药材对仓储害虫具有一定的毒性作用,但对进食率影响不大。

趋避距离结果显示:空白组中昆虫在加入乙醇后,均往玻璃格边缘靠近。随着实验开始,昆虫活动区域开始逐渐变大,喷洒区域也开始出现活动迹象,慢慢聚集在进食区域,昆虫趋避距离从10～15 cm降低为5～8 cm。余甘子精油组中,药材甲,咖啡豆象,米象,印度谷蛾开始明显远离进食区域,分散在边缘处,且初始趋避距离较大,在10～15 cm以上。其中米象的趋避距离甚至随时间推移增加,达到18 cm左右。其他昆虫趋避距离有一定下降趋势,但整体明显高于空白组。余甘子药材组中4种昆虫在开始明显远离进食区域,主要分布在边缘处以及进食区与边缘处中间位置,趋避距离达到9～13 cm。随着时间推移,趋避距离虽有一定下降,但是下降趋势较精油组更弱。以上结果显示,余甘子药材和精油短期内驱虫效果明显,以精油最佳。

3 讨论

近年来,利用植物源性杀虫剂控制仓储害虫的研究已引起了广泛关注。其具有良好的生物活性,是绿色驱虫剂的替代品之一,具有抗菌、消炎、抗氧化、驱蚊和驱虫的作用,对环境友好、对人畜安全,易于分解,并有使节肢动物产生耐药性降低的可能[11]。

研究发现,高含量的酸类成分可能是余甘子久置不腐的原因之一[12]。乙酸乙酯对昆虫有一定的麻醉作用,在昆虫学实验中,乙酸乙酯是一种常用的窒息剂,常用于昆虫的采集[13],具有一定的驱虫作用。此外,α-松油醇广泛存在于植物精油中,对玉米象、小菜蛾等害虫具有良好的趋避和杀虫活性,致死中浓度为3.22 mg/L左右,是一种不可多得的天然产物[14]。而一种抗虫的重要物质芳樟醇在药材中大量存在,但是在精油中含量更少[15]。推测可能和其自身理化性质有关,需要进一步优化提取工艺。此外,余甘子精油和药材中还含有一定的薄荷脑、香叶醇、苯酚、萘等成分,是一类具有一定抗虫驱虫及抗菌作用的物质[11],但含量相对较低,可能起到辅助作用。综合来看,其抗虫作用更是“多组分、多效应、多层次”的综合结果,上述成分可能是余甘子“芳香避秽”的物质基础[16-17]。

此外,由于提取极性的原因,超临界提取大部分是极性较弱的成分,而部分抗虫成分如乙酸乙酯、芳樟醇及一些抗微生物的成分如乙酸、丙酸、丁酸等含量较少,但α-松油醇等萜烯类及单萜类含量较高。这导致药材和精油的抗虫作用各有自身特点。药材中小分子酸类成分等抗虫抑菌成分含量较高,而精油中脂溶性萜类成分明显含量更高。抗虫成分主要以萜烯类成分为主,总体而言精油的抗虫效果更佳。综合抗虫作用研究表明,余甘子的抗虫作用较强,但表现为驱虫作用而非杀虫作用。但其抗虫作用可能并非单一成分的作用,而是“多组分、多效应、多层次”的协同作用结果[18]。后期可进一步通过气味结合蛋白、气味受体的触角生物电位作用筛选抗虫关键成分[19-20],探明抗虫机制,进一步优化其提取制备工艺。本文首次提出余甘子抗仓储害虫作用,对其物质基础进行研究,并初步评价了其抗虫活性,以期为余甘子抗虫作用挖掘和应用开发提供参考。