鲁氏毛霉与乳酸菌复配发酵对咖啡奶酪风味的影响

洪宾，白如彬，任慧玲，姜珊珊，乌日娜,2,3，史海粟,2,3*

1(沈阳农业大学 食品学院，辽宁 沈阳，110866) 2(辽宁省食品发酵技术工程研究中心，辽宁 沈阳，110866) 3(沈阳市微生物发酵技术创新重点实验室，辽宁 沈阳，110866)

奶酪又叫干酪，是一种以乳、稀奶油、脱脂乳、酪乳或其混合物为原料，向其中加入少量发酵剂和凝乳酶经过发酵，使酪蛋白凝聚，排除乳清，待成熟后制成的一种高营养的发酵乳制品[1-2]。奶酪是一个复杂的微生物生态系统，由多种不同的微生物组成[3]。例如，在奶酪生产中，乳酸菌用作产酸的起始培养物，而酵母、霉菌、其他细菌和异型发酵乳酸杆菌则参与成熟过程[4]。此外，真菌菌株有助于形成特定的感官特征。使用可见真菌菌丝体发酵奶酪是奶酪生产中最早的方法之一[5]。

霉菌奶酪虽很受欢迎，但并未大规模生产(占全球奶酪总产量的3%，占欧洲总奶酪产量的8%)[6]。霉菌奶酪又分为2个亚型，(1)是表面成熟霉菌奶酪，如卡门培尔奶酪和布里干酪，通常由卡门贝蒂青霉催熟，形成天鹅绒般的白色外皮。(2)是内部成熟霉菌奶酪，如蓝纹奶酪，其作为一款高蛋白、高维生素、高钙和高矿物质以及具有独特风味的即食性食品，是国际市场上交易量最大的乳制品之一[7-8]。李昂等[9]探究了雅致放射毛霉添加量对牦牛霉菌奶酪品质的影响，发现当发酵剂的添加量为0.3%，发酵6 d时，牦牛霉菌奶酪的品质最佳。对卡门贝尔青霉和乳酸菌联合发酵的干酪的挥发性物质进行代谢组学分析，发现乳酸菌对卡门贝尔霉菌产生的支链脂肪酸、月桂酸、油酸、亚油酸、支链醇等挥发性风味物质有增强作用[10]。

现有的咖啡发酵乳制品主要有咖啡乳酒和咖啡发酵含乳饮料，且发酵菌种单一，口感与风味较为局限。本研究将我国传统腐乳发酵菌鲁氏毛霉与复合乳酸菌复配，制作一种新型的奶酪发酵剂，并将咖啡粉用于奶酪制作中，开展咖啡奶酪的加工工艺及其品质研究。制备的咖啡奶酪产品，有助于满足国内对奶酪及其新品的需求，以期为拓宽奶酪产品市场提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：纯牛奶，辉山乳业有限责任公司；腐乳曲、复合乳酸菌(保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌=1∶1)、白砂糖，安琪酵母股份有限公司；咖啡粉，日本AGF株式会社；凝乳酶，深圳富晟生物科技有限公司；CaCl2，河南万邦实业有限公司；NaCl，中盐长江盐化有限公司，以上材料均为食品级。实验其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DHP-9162电热恒温培养箱，宁波乐电仪器制造有限公司；7890A-5975A气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦科技有限公司；CR21 N高速冷冻离心机，日本日立株式会社；SA402B型电子舌，日本Insent公司；K9840自动凯氏定氮仪，济南海能仪器股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵剂菌种复配比例筛选

将筛选得到的鲁氏毛霉与复合乳酸菌组合按照不同复配比例分组，分别按3%的量接种于牛乳中，混合均匀，37 ℃培养，测定凝乳时间、凝乳酸度、凝乳pH值、乳清OD值和奶酪出品率，并观察凝乳气味、组织状态，综合比较筛选出最优比例组合。

凝乳时间：记录37 ℃下不同复配比例的凝乳时间；凝乳酸度：根据GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》方法进行测定，结果用吉尔涅尔度/°T表示；凝乳pH值：采用pH计于室温下直接测定；乳清OD值：将收集到的乳清加水稀释10倍后，用紫外分光光度计测定其在λ=500 nm处的吸光值[8]；奶酪出品率计算如公式(1)所示：

(1)

式中：x，奶酪的出品率，%；m1，奶酪排乳清之前的质量，g；m2，奶酪排乳清之后的质量，g。

1.3.2 咖啡奶酪工艺流程

鲜牛乳→添加咖啡→添加发酵剂→牛乳酸化→添加CaCl2→添加凝乳酶→静置凝乳→切割→升温搅拌→入模排乳清→加盐后发酵→冷藏→成品

1.3.3 单因素试验

选取发酵剂添加量、咖啡添加量、白砂糖添加量、凝乳酶添加量、CaCl2添加量以及凝乳温度等几个不同因素设计单因素试验，其余因素取中间值。分别从奶酪的凝乳时间、出品率、乳清OD值、感官评分以及凝乳的质地与气味等几个方面进行评价，确定最佳的单因素水平，单因素试验水平见表1。

表1 单因素试验设计Table 1 Single-factor experimental design

1.3.4 响应面法优化

在单因素试验的基础上，以奶酪的出品率为指标，考察发酵剂添加量、咖啡添加量以及凝乳温度对奶酪出品率的影响，确定响应面优化最佳因素水平。因素与水平见表2。

表2 响应面因素水平设计Table 2 Response surface experiment factor and level design

1.3.5 感官评价

感官评分标准如表3所示。

表3 咖啡奶酪感官评分标准Table 3 The sensory scoring standards of coffee cheese

1.3.6 电子舌评价

参考王嫱[11]的方法，采用电子舌对不同后发酵时期复配发酵咖啡奶酪的主要风味进行分析，并以复合乳酸菌发酵样品作为对照。

1.3.7 理化指标测定

水分：按照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》；灰分：按照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》第一法进行测定；蛋白质：按照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》；脂肪：按照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》第一法进行测定；pH值：称取奶酪样品研磨后，与蒸馏水以质量比1∶1混合后均质2 min，用pH计测定。

1.3.8 质构分析

参考郭琳仪[12]的方法，采用质构仪对奶酪进行质构分析(texture profile analysis，TPA)。将奶酪样品切割成1 cm3的小块，分别测定复配发酵咖啡奶酪的各项性能，并以复合乳酸菌发酵咖啡奶酪作对照。

1.3.9 挥发性风味物质测定

采用顶空固相微萃取，称取5 g样品，放入20 mL顶空瓶内，参考王嫱[11]的方法，略作修改，对奶酪的挥发性风味物质进行测定。

1.3.10 游离脂肪酸含量测定

准确称取5 g奶酪样品，将样品放入研钵中充分研磨，全部转移至圆底烧瓶中，参考史海粟[13]的方法对游离脂肪酸进行提取并甲酯化后，进GC-MS测定。

1.4 数据分析

每个试验重复3次，以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析(ANOVA)，在5%的概率水平上进行平均值比较的邓肯检验方法(P<0.05)。数据统计采用WPS Office 2021软件，作图采用GraphPad Prism 8.0软件。

2 结果与分析

2.1 发酵剂复配比例对凝乳特性的影响

以发酵乳的凝乳时间、凝乳酸度、凝乳pH值、奶酪的出品率、乳清OD值等为评价指标，分别对不同复配比例的样品进行评价。结果表明(表4)，当毛霉∶复合乳酸菌=2∶1时，咖啡奶酪的凝乳时间为(30±5) min，乳清OD值为(0.2±0.01)，出品率为(20.15±0.74)%，综合评分高于其他比例。奶酪的凝乳时间太长会导致生产效率低下，不利于工业化生产并且染菌几率也大大增加[14]。而乳清的OD值越高说明奶酪凝乳越差，固形物流失较多，导致奶酪的出品率较低[15]。

表4 发酵剂复配比例对凝乳特性的影响Table 4 Effect of starter compound ratio on the characteristics of curd

研究毛霉与复合乳酸菌不同复配比例下凝乳的状态与气味发现(表5)，随着毛霉的配比降低，奶酪的凝乳状态呈先上升后下降的趋势，当毛霉与复合乳酸菌的比例为2∶1时，奶酪的凝乳状态最佳。凝乳状态的好坏直接影响了奶酪的品质以及感官评分。因此，良好的凝乳质地对奶酪的生产至关重要。在对凝乳的各项评价指标进行综合考量后，发酵剂的最优复配比例确定为毛霉∶复合乳酸菌=2∶1。

2.2 单因素试验结果

分别对奶酪的凝乳时间、出品率、乳清OD值、感官评分以及凝乳的质地与气味等几个方面进行评价，并观察不同凝乳温度下凝乳的质地、气味和色泽的变化，确定最佳的单因素水平。单因素试验结果表明，咖啡奶酪的最佳工艺条件是：发酵剂、咖啡、白砂糖、凝乳酶和CaCl2的质量分数分别为2.5%、1%、4%、0.25%和0.2%，凝乳温度33 ℃。

表5 发酵剂复配比例对凝乳质地与气味的影响Table 5 Effect of starter compound ratio on the texture and smell of curd

2.3 响应面结果

在单因素试验的基础上，以发酵剂添加量(A)、咖啡添加量(B)以及凝乳温度(C)等3个因素为自变量，咖啡奶酪的出品率(Y)为响应值，采用Box-Behnken对咖啡奶酪的工艺参数进行优化。响应面试验结果与分析见表6，方差分析见表7。

表6 咖啡奶酪工艺条件优化响应面试验设计及结果Table 6 Design and results of response surface experiments for the optimization of coffee cheese processing

经Design Expert 10.0.7软件对表6中的数据进行多元回归拟合，得到咖啡奶酪的出品率(Y)的响应面回归方程为：

Y=19.70+0.034A+0.25B+0.36C+0.045AB-0.23AC-0.098BC-0.69A2-0.84B2-0.51C2

由表7可知，数据模型具有显著性(P<0.05)，失拟项检验P=0.152>0.05，不显著，说明试验模型能很好地拟合实际情况，可以用于咖啡奶酪的工艺参数优化。3个因素对咖啡奶酪感官评分影响的主次顺序依次为C>B>A，即凝乳温度>咖啡添加量>发酵剂添加量，其中二次项B2对结果影响极显著(P<0.01)，二次项A2对结果影响显著(P<0.05)，其他项则对结果影响不显著(P>0.05)。

根据咖啡奶酪出品率回归方程得出不同因子的响应面分析图，结果见图1。因素A与因素B之间以及因素B与因素C之间所形成的响应面曲面坡度在两因素交互作用响应面图中更为陡峭，说明因素A与因素B以及因素B与因素C之间具有更强的交互作用。

表7 回归模型的方差分析Table 7 Analysis of variance for regression models

通过Design Expert 10.0.7软件分析确定咖啡奶酪的最佳发酵工艺条件为发酵剂添加量2.5%，咖啡添加量1%，凝乳温度33 ℃，在此条件下，咖啡奶酪的出品率为19.55%。

a-发酵剂添加量与咖啡添加量；b-发酵剂添加量与凝乳温度；c-咖啡添加量与凝乳温度图1 各因素交互作用对咖啡奶酪出品率影响的响应面图Fig.1 Response surface plot of interaction of various factors on the yield of coffee cheese

2.4 电子舌测定结果

分别对复配发酵咖啡奶酪和复合乳酸菌发酵的咖啡奶酪进行电子舌测定。由电子舌自带的分析软件将传感器电势值转化成味觉值，最后3次测得的味觉的平均值如图2所示，2种咖啡奶酪的苦味均随着发酵时间的延长，而不断减小，但对照组的苦味整体上大于复配发酵组。随着发酵时间的延长，酸味和甜味也在不断减小。复配发酵的样品与对照组相比味觉更加柔和且鲜味更足。奶酪中的苦味和涩味可能是由咖啡产生的。

a-试验组；b-对照组图2 电子舌检测结果的雷达图Fig.2 Radar chart of electronic tongue detection results

2.5 理化指标测定结果

如表8所示，奶酪的水分含量随着发酵时间的延长逐渐减少。一方面由于游离水的蒸发使得水分流失[16]，另一方面是在酶和微生物的作用下蛋白质逐渐被分解，奶酪的网状结构受到破坏，产生大量的自由水[9,17]。试验组的蛋白质含量随着发酵时间的延长而逐渐减少，这可能是由于毛霉的加入，增强了分解蛋白质和脂肪的能力，蛋白质被分解成肽、游离氨基酸等小分子化合物，造成蛋白质含量下降[18]。2种奶酪的脂肪含量均随着发酵时间的延长逐渐减少，由于毛霉的脂肪酶分泌能力较强，从而促进脂肪分解为脂肪酸，而脂肪分解是脂肪酸的主要来源[19]。pH随着发酵时间的延长先减小后增大。后发酵前期由于乳糖分解产生乳酸的作用，同时脂肪被分解成脂肪酸，导致奶酪pH值降低；随着后发酵时间的延长，霉菌在奶酪表面不断生长并产生蛋白水解酶，蛋白质分解产生NH4+的反应处于优势，NH4+中和一部分游离氢离子，使得成熟后期pH值保持不变或呈上升趋势[20-21]。

表8 咖啡奶酪不同理化指标测定结果

2.6 质构分析结果

分别对2种咖啡奶酪的质构特性进行测定(图3)，发现2种奶酪的硬度、内聚性、弹性和胶着性均随着发酵时间的延长而逐渐增大。随着发酵时间的延长，奶酪中的水分不断减少，导致奶酪硬度增大。并且毛霉的加入增强了分解蛋白质的能力，破坏了蛋白质的网状结构，使得奶酪结构松散，弹性有所损失。而奶酪的咀嚼性随着发酵时间的延长而不断降低，无论奶酪类型如何，成熟过程中咀嚼性都会下降，并且该参数值的降低会继续增加蛋白质水解，导致酪蛋白网络状结构松散[22]。

a-硬度；b-内聚性；c-弹性；d-胶着性；e-咀嚼性图3 咖啡奶酪质构随后发酵时间的变化Fig.3 Changes in the textures of coffee cheese during post fermentation 注：不同小写字母代表显著性差异，P<0.05

2.7 挥发性风味物质测定结果

采用GC-MS对咖啡奶酪成品的挥发性风味物质进行测定，由图4-a可知，复配发酵咖啡奶酪风味物质的种类要多于对照组样品，如亚油酸、月桂酸乙酯、癸酸甲酯、月桂酸甲酯等风味物质在对照组样品中均未检测到。而复配发酵的奶酪样品中亚油酸的含量达到了(433.28±5.79) mg/100 g，月桂酸乙酯的含量为(84.25±4.61) mg/100 g，癸酸甲酯和月桂酸甲酯的含量分别达到了(371.13±4.24) mg/100 g和(91.88±3.22) mg/100 g。且复配发酵样品中的丁酸、月桂酸、肉豆蔻酸和油酸等物质的含量均大于对照组，丁酸和月桂酸的含量分别为(124.90±1.05)和(507.30±7.58) mg/100 g，是对照组的10倍。因此，复配发酵咖啡奶酪的风味更加丰富。

2.8 游离脂肪酸含量测定结果

对成品的咖啡奶酪的游离脂肪酸进行测定，如图4-b所示，共检测出10种主要脂肪酸。其中，棕榈酸的含量最高，分别达到了(5.73±0.36)和(8.16±0.14) mg/100 g。其次为硬脂酸，含量分别为(6.78±0.12)和(7.19±0.10) mg/100 g。结果显示，复配发酵样品的不饱和脂肪酸含量明显高于对照组。其中，亚油酸含量为(0.90±0.07) mg/100 g，是对照组的8倍。由于毛霉的加入产生了更多的脂肪酶，增强了分解脂肪的能力。多不饱和脂肪酸除了具有基本的营养功能外，还具有生理功能，可以降低患慢性病的风险。这些功能性多不饱和脂肪酸具有柔韧性、流动性和选择性透膜特性，因此对人类健康具有很高的生理和治疗意义[23-24]。

a-挥发性风味物质；b-游离脂肪酸图4 咖啡奶酪中的挥发性风味物质与游离脂肪酸含量Fig.4 Content of volatile flavor substances and free fatty acids in coffee cheese

3 结论

将我国传统腐乳发酵菌鲁氏毛霉与复合乳酸菌复配，制作一种新型的奶酪发酵剂，并将咖啡粉用于奶酪制作中，开展咖啡奶酪的加工工艺及其品质研究。试验结果表明，复配发酵剂对咖啡奶酪的品质及风味均有所提高。复配发酵剂菌种间的互作关系、复配发酵剂导致风味变化的机理以及其在其他类型奶酪中的应用等还有待进一步研究。所制备的咖啡奶酪产品有助于满足国内对奶酪需求量的增加，和人们对上市新品的需求，为我国奶酪产品的开发利用提供一定的理论和实践基础。