钝齿棒杆菌异源表达乙酰辅酶A合成酶对L-精氨酸合成的影响

吴洁琴，石电，徐华，张显，杨套伟，徐美娟，饶志明

(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)

L-精氨酸在医药、畜牧等行业扮演重要角色[1]。随着遗传操作技术的发展，代谢工程改造被广泛应用于L-精氨酸高产菌株的选育中，使得L-精氨酸生产菌株的产率得到了极大的提高[2]。钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)不仅是L-脯氨酸、L-鸟氨酸、L-谷氨酸的生产菌，也是L-精氨酸的优势菌株。如图1所示，钝齿棒杆菌以葡萄糖为碳源转化为乙酰辅酶A，然后乙酰辅酶A经过三羧酸循环等代谢途径后转化成前体L-谷氨酸，L-谷氨酸通过位于同一基因簇上精氨酸主合成途径所有酶的编码argCJBDFRGH基因簇来催化合成L-精氨酸。在精氨酸合成途径中，乙酰辅酶A连接着糖酵解、三羧酸循环、氨基酸合成等重要代谢途径，是微生物代谢的重要中心枢纽[3]。乙酰辅酶A可以通过pta基因编码的磷酸乙酰基转移酶及ack基因编码的乙酸激酶合成乙酸，由于乙酸含量的积累，不仅会影响钝齿棒杆菌的生长代谢能力，也会降低乙酰辅酶A通量和L-精氨酸产率[4]。

图1 钝齿棒杆菌SYPA5-5中L-精氨酸氨酸合成途径Fig.1 L-arginine biosynthesis pathway in C. crenatum SYPA5-5

在代谢工程中，针对乙酰辅酶A通量调控的常见方法是通过乙酸途径[5]，将乙酸途径合成基因敲除后，既能够降低乙酸对菌体的毒害作用，又能提高乙酰辅酶A合成。早期研究发现，pta-ack基因敲除后增强了乙酰辅酶A的通量，但同时也会增加副产物D-乳酸的含量，影响菌株的生长[6]，其原因是由于乙酰辅酶A合成乙酸，是ATP的来源途径之一，且乙酸合成途径产物乙酰磷酸也是细胞信号调节的重要物质，敲除乙酸合成途径会影响流向乙酰辅酶A和丙酮酸的代谢流途径[7]。因此，如何通过改造乙酸生产途径调控乙酸与乙酰辅酶A的转化，是生产与辅酶A(coenzyme A,CoA)相关生物化学品的研究热点。ZHA等[8]在大肠杆菌中通过过表达乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthetases，ACS)，提高了乙酸流向乙酰辅酶A通量，将丙二酰辅酶A合成产率提高了4倍多。XIAO等[9]发现，乙酸能够通过ACS转化生成乙酰辅酶A，他们在大肠杆菌内表达ACS，有效利用乙酸使脂肪酸达到0.9 g/L。综上所述，过表达ACS是增强乙酸向乙酰辅酶A的转化有效策略之一。

在大肠杆菌和枯草芽胞杆菌中有1个ACS[10]，巴氏醋酸杆菌(Acetobacterpasteurianus)内有2个ACS，分别为ACS1和ACS2[11]。本研究分别克隆表达了来自于EscherichiacoliBL21、Bacillussubtilissubsp.subtilis str.168及AcetobacterpasteurianusATCC 33445中的基因acs。将4种ACS克隆表达后，测定酶的pH和温度稳定性，选择最佳酶活性的来源巴氏醋酸杆菌中的ACS编码基因Apacs1，构建重组菌株SYPA5-5/pXMJ19-Apacs1(命名为SYPA-ACS)，在C.crenatum中强化ACS的表达，测定重组菌株SYPA-ACS发酵产精氨酸的能力。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

CorynebacteriumcrenatumSYPA5-5是由本实验室保藏[12]的L-精氨酸生产菌株；EscherichiacoliBL21用于扩增基因Ecacs、Bacillussubtilissubsp.subtilis168用于扩增基因Bsacs，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；AcetobacterpasteurianusATCC 33445，购于ATCC工业微生物菌种保藏中心，用于扩增基因Apacs1和Apacs2；JM109，上海生物工程有限公司；质粒pET28a和pXMJ19，大连生物工程有限公司；重组质粒pET28a-Ecacs、pET28a-Bsacs、pET28a-Apacs1、pET28a-Apacs2、pXMJ19-Apacs1，均由本实验室构建，使用的菌株、质粒及引物见表1和表2。

表1 本实验所用的菌株及质粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用到的引物Table 2 Primers used in this study

1.2 工具酶与试剂

质粒提取和胶回收试剂盒，上海生物工程有限公司；ATP检测试剂盒、NAD+/NADH、NADP+/NADPH检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；乙酰辅酶A(acetyl-CoA)含量测定试剂盒，齐源生物有限公司；乙酸盐检测试剂盒，金畔生物有限公司；taqDNA聚合酶、ExtaqDNA聚合酶、Primer StarDNA聚合酶、Hind Ⅲ、XbaI、EcoR I 限制性内切核酸酶，宝日医生物技术有限公司；苹果酸脱氢酶、柠檬酸合酶、L-苹果酸、CoA、ATP、NAD+，索莱宝科技有限公司；L-精氨酸、乙酸钾，阿拉丁生物试剂公司；其余所用试剂均来自于国药集团化试剂有限公司。

1.3 主要仪器设备

PCR仪、电转仪，德国Eppendorf公司；凝胶成像仪，英国UVP有限公司；恒温培养箱，上海博讯实业有限公司；往复式摇床，上海智诚有限公司；UV2000分光光度计，UNIC(上海)仪器有限公司；SBA-40C生物传感器，山东省科学院生物研究所；5 L发酵罐，Biotech上海保兴生物设备工程有限公司；1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司。

1.4 培养基及培养方法

Luria-Bertani(LB)液体培养基(g/L)：NaCl 10，酵母粉5，蛋白胨10，pH 7.0。

醋酸杆菌培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母粉10，pH 5.5，灭菌后加入无水乙醇40 mL。

钝齿棒杆菌电转感受态培养基(g/L)：吐温-80 100 μL，NaCl 10，蛋白胨10，甘氨酸3，酵母粉5。

种子培养基(g/L)：酵母粉20，葡萄糖40，(NH4)2SO425，MgSO4·7H2O 1，KH2PO41.5，用氨水调pH至7.2。

摇瓶培养基(g/L)：酵母粉20，葡萄糖120，(NH4)2SO440，MnSO40.02，FeSO4·7H2O 0.02，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41.5，CaCO320，用氨水调 pH至 7.2。葡萄糖与其他成分分开灭菌。

5 L发酵培养基(g/L)：酵母粉20，葡萄糖80，(NH4)2SO440，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41.5，MnSO40.02，FeSO4·7H2O 0.02，用氨水调pH至7.2。

所有培养基均115 ℃灭菌20 min。

发酵培养条件：将钝齿棒杆菌菌株活化后接种于发酵培养基中，30 ℃、200 r/min摇床发酵培养96 h后测定发酵液产量。5 L发酵罐培养方法参考文献[13]。

1.5 不同来源的乙酰辅酶合成酶的筛选及酶学性质

1.5.1 乙酰辅酶合成酶表达载体的构建

经BRENDA酶数据库和NCBI基因组信息数据库分析，结合本实验室已有的菌株，分别以E.coliBL21、B.subtilissubsp．subtilisstr．168和A.pasteurianusATCC 33445的基因组为模板，采用Primer StarDNA扩增基因ECacs、Bsacs、Apacs1和Apacs2，回收目的扩增片段，目的片段再连接到线性质粒载体上，转化至大肠杆菌感受态细胞中。

1.5.2 乙酰辅酶合成酶的表达与纯化

构建成功的重组大肠杆菌活化后接种于10 mL LB 培养基，37 ℃培养8～12 h，然后转接至50 mL摇瓶中，培养菌液OD600值为0.8～1.0左右时，加入0.5 mmol/L的IPTG溶液，16 ℃下过夜诱导。诱导结束后，离心收集菌体细胞，用PBS悬浮细胞菌体2次后，最后加入5 mL PBS悬浮菌体。破碎悬浮细胞溶液直至菌液澄清，4 ℃、12 000 r/min离心20 min分离上清液与细胞沉淀，上清液通过SDS-PAGE来验证目的蛋白质[14]，分析目标蛋白表达情况以及进行后续的酶活性测定或蛋白纯化实验。利用His-Trap HP 纯化柱纯化目的蛋白[15]，利用牛血清血蛋白测定蛋白浓度[16]。

1.5.3 ACS活性测定

将纯化后的4种不同来源的ACS进行酶活力测定[17]。1 mL反应体系包含：100 μmol Tris-HCl(pH 7.4)、10 μmolL-苹果酸、10 μmol MgCl2、1 μmol NAD+、0.2 μmol CoA、3 U苹果酸脱氢酶、43.3 U柠檬酸合酶、10 μmol乙酸钾、10 μmol ATP、100 μL的纯化酶液，加入ATP开始反应。在柠檬酸合酶和苹果酸脱氢酶的作用下，能够将乙酰辅酶A的生成率与NADH的生成率关联起来，通过分析340 nm处的NADH的生成率，确定ACS的酶活力。

1.5.4 酶学性质的研究

酶的最适pH及温度确定：将缓冲液设定为不同pH，测定ACS最适反应pH；在不同梯度温度条件下，测定最适温度，最高酶活力定义为100%。温度稳定性研究：将缓冲液置于不同温度下(20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃)，加入酶液后，测定相对酶活力。pH稳定性研究：将缓冲液设定为不同的pH条件(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10)，加入纯酶液，孵育30 min,测定相对酶活力，初始酶活力定义为100%。温度稳定性研究：将4种ACS纯酶液分别置于不同温度(20、30、40、50、60 °C)，温浴1 h后测定残余酶活力，将初始测定的酶活力设置为100%。动力学参数研究：改变底物浓度(分别为5、10、20、40、60、80、100 mmol/L)，测定酶活力。以Hill方程V=Vmax(Sn)/(Kn+Sn)进行线性拟合。

1.6 重组钝齿棒杆菌SYPA-ACS的构建

选择最优来源的ACS编码基因acs，用限制性内切酶酶切质粒载体pXMJ19，经纯化试剂盒回收后与目的扩增基因酶连接，获得重组质粒利用电转化入SYPA5-5感受态中[18]。挑取阳性转化子单菌落，利用引物P19-F、P19-R进行验证分析，将构建成功的重组钝齿棒杆菌菌株SYPA5-5/pXMJ19-Apacs1(命名为SYPA-ACS)的阳性转化子进行培养。

1.6 发酵参数的测定

1.6.1 菌体生物量的测定

取定量的发酵液，用0.125 mol/L HCl溶液去除发酵液中的CaCO3沉淀后，采用紫外分光光度计测定菌液在562 nm处细菌OD值，细菌干重(dry cell weight,DCW)与细菌OD562值的关系为OD562=0.375 g/L DCW[19]即OD562=1时，DCW为0.375 g/L。

1.6.2 葡萄糖含量的测定

将定量发酵液离心后取上清液，利用生物传感器测定发酵液中葡萄糖的含量。

1.6.3 乙酸含量的测定

取定量发酵液离心，将上清液稀释一定倍数后，采用乙酸盐检测试剂盒测定发酵液中乙酸的含量。

1.6.4 游离氨基酸的测定

将发酵液离心，取上清液稀释一定倍数，采用高效液相色谱仪测定。

2 结果与分析

2.1 不同来源ACS的克隆与表达

以4种不同的菌株为扩增模板，获得Ecacs、Bsacs、Apacs1、Apacs2基因片段，与线性化pET28a载体进行连接，化学转化至大肠杆菌感受态，采用表1中的引物，对重组菌株进行菌落PCR验证，验证扩增产物大小为1 959、1 719、1 923、1 989 bp(图2)，分别对应Ecacs、Bsacs、Apacs1、Apacs2，符合它们的理论大小，通过以上实验，成功构建了pET28a-Ecacs、pET28a-Bsacs、pET28a-Apacs1、pET28a-Apacs2质粒，将构建的质粒进行测序分析，验证结果正确，表明重组质粒构建成功。

将过夜诱导表达的BL21/pET28a的菌液经超声波破碎后，取上清液进行验证分析。通过SDS-PAGE分析检测到分子质量约为71.83、66.06、70.51、72.93 kDa的特异性条带，如图3-a所示，不同acs基因在大肠杆菌中成功表达。

M-DNA Marker;1-Ecacs;2-Bsacs;3-Apacs2;4-Apacs1;5-pET28a-Ecacs;6-pET28a-Bsacs;7-pET28a-Apacs2;8-pET28a-Apacs1a-目的基因PCR扩增验证电泳图谱；b-重组质粒双酶切验证电泳图谱图2 acs基因的PCR及质粒pET28a-acs酶切验证结果Fig.2 PCR results of acs genes and identification of pET28a-acs plasmids and pET28a plasmid by double enzyme digestion

M-标准蛋白Marker;1-pET28a;2-pET28a-Ecacs;3-pET28a-Bsacs;4-pET28a-Apacs2;5-pET28a-Apacs1;6-pET28a-Ecacs;7-pET28a-Bsacs;8-pET28a-Apacs2;9-pET28a-Apacs1a-重组大肠杆菌E.coli BL21/pET28a-acs细胞破碎上清液；b-重组大肠杆菌E.coli BL21/pET28a-acs细胞破碎上清液纯化后图3 重组菌株粗蛋白及ACS纯化SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of crude proteins and purification

纯化后测定ACS活力，测定结果如表3所示，ACS酶液活力为328.44、50.44、784.59、119.93 U/mL，表明4种来源的ACS中，A.pasteurianus来源的ACS1酶活力最高，对底物乙酸钾亲和力也更高。

表3 本实验涉及的ACS重组酶的酶学性质Table 3 Enzymatic properties of recombinant enzymes used in this study

2.2 ACS的酶学性质的研究

ACS的最适温度结果如图4-a所示，4种不同ACS最适温度均在30～40 ℃范围内，然而随着反应温度的升高，ACS的酶活力也会逐渐上升，当温度超过一定范围后，酶的催化能力反而会下降，其原因是随着温度的上升，ACS蛋白失活，ACS基本没有了催化活性。ACS的最适pH见图4-b，在pH 7.0～8.0范围内，4种不同ACS的均为最适反应，随着缓冲液pH的增高，ACS的酶催化能力也逐渐下降。ACS的温度稳定性结果如图4-c所示，4种不同ACS在20～40 ℃均有较好的温度稳定性，1 h后的残余酶活力仍在50%以上，其中ApACS1的温度稳定性明显优于其他3种ACS。ACS的反应pH稳定性结果如图4-d所示，ApACS1的pH稳定性明显优于其他3种ACS，在pH 5.0～9.0孵育30 min，仍能保持50%的酶活力。综上所述，ApACS1最适温度为37 ℃，最适pH为7.0，与其他3种ACS的温度稳定性和pH稳定性相比，ApACS1稳定性更好。

a-最适温度;b-最适pH;c-最适温度稳定性;d-最适pH稳定性图4 四种ACS 的酶学性质比较Fig.4 Comparison of the properties of four kinds of ACS

2.3 重组钝齿棒杆菌SYPA-ACS的构建

将A.pasteurianus来源的ACS编码基因acs1，与线性化质粒pXMJ19连接后转化至JM109感受态中，涂布于抗性平板，利用表2的引物进行菌落PCR，并进行酶切验证。如图5-a所示，在1 000～2 000 bp有明亮条带，符合Apacs1长度大小，在4 000～7 000 bp有明亮条带，符合pXMJ19线性化后的长度大小，表明pXMJ19-Apacs1重组质粒构建成功。

提取构建成功的重组质粒pXMJ19-acs1，电击转化进SYPA5-5，涂布含有氯霉素抗性平板上，利用引物表2中的引物菌落PCR，验证SYPA-ACS阳性菌落。挑选出发菌株SYPA5-5和SYPA-ACS于培养基中，30 ℃培养12 h转接至种子培养基，诱导后离心收集菌体并破碎，取上清液进行验证分析。如图5-b所示，ApACS1在钝齿棒杆菌中的表达大小为70.51 kDa，表明重组质粒pXMJ19-acs1在菌株SYPA5-5成功表达，重组菌株SYPA-ACS构建成功。

M-DNA Marker;1-pXMJ19-Apacs1双酶切;2-标准蛋白Marker;3-出发菌株细胞破碎上清液;4-重组菌株细胞破碎上清液a-重组质粒pXMJ19-Apacs1双酶切验证;b-重组SYPA 5-5/pXMJ19-Apacs1菌株细胞破碎上清液图5 构建SYPA 5-5/pXMJ19-Apacs1菌株及重组菌株粗酶液SDS-PAGE分析Fig.5 Construction of SYPA 5-5/pXMJpXMJ19-Apacs1 and SDS-PAGE analysis of the overexpression of ApACS1 in recombinant strains

2.4 SYPA5-5与SYPA-ACS菌株摇瓶发酵比较

分别测定SYPA5-5与SYPA-ACS菌株粗酶液中ACS活力，如表4所示，重组菌株SYPA-ACS粗酶液的ACS活力为45.08 U/mL，证明重组菌株SYPA-ACS的ACS表达量加强。将上述的SYPA5-5与SYPA-ACS菌株进行摇瓶发酵实验，在种子培养基中培养至对数生长后转接摇瓶发酵培养基，培养96 h后，测定发酵产物参数。根据图6所示，重组菌株SYPA-ACS摇瓶发酵产量为33.14 g/L，相比较SYPA5-5菌株，产量提高21.39%，乙酸含量为0.836 g/L，与SYPA5-5相比，下降66.41%。利用试剂盒测定菌株乙酰辅酶A含量，表4显示，SYPA-ACS菌株乙酰辅酶A含量为3.34 nmol/mg，比SYPA5-5提高了31.6%。以上结果表明，在钝齿棒杆菌中过表达ACS，能够有效利用乙酸转化增强乙酰辅酶A的产率，进一步提高L-精氨酸产率。

表4 不同菌株摇瓶发酵产量Table 4 Shake flask fermentation yield of different strains

为了验证acs1基因的过表达对胞内ATP、NADH和NADPH水平的影响，利用试剂盒测定SYPA5-5和SYPA-ACS菌株在对数生长期的胞内ATP、NADH和NADPH含量，结果如图6-b所示。由于acs1基因的过表达，SYPA-ACS菌株的胞内ATP与NADH水平为4.87、11.01 μmol/g DCW，与出发SYPA5-5菌株相比分别提高了13.71%、280.67%，同样，我们也测量了SYPA-ACS菌株的胞内NADPH含量为21.65 μmol/g DCW，相比较原始菌株含量增加了213.61%。由上述结果可知，利用乙酸提高乙酰辅酶A的含量对胞内ATP、NADH和NADPH提高有显著的效果，其原因可能是随着ACS的过表达，糖酵解、三羧酸循环等代谢途径也随之增强，伴随着ATP的合成，同时也为细胞信号调节提供重要物质乙酰磷酸，提高了重组菌株中NADH、NADPH含量。由于在L-精氨酸合成途径中，合成1分子L-精氨酸需要消耗5分子ATP与2分子NADPH，因此，ATP、NADH和NADPH含量提高，也有助于L-精氨酸的合成。

a-SYPA5-5、SYPA-ACS菌株摇瓶发酵产量;b-菌株胞内ATP、NADH和NADPH含量图6 钝齿棒杆菌摇瓶发酵Fig.6 Shake flask fermentation of strains

2.5 菌株发酵过程比较

根据菌株在5 L发酵罐发酵的结果可以分析出重组菌株SYPA-ACS产酸能力高于出发菌株SYPA5-5。如图7所示，在发酵培养前期，重组菌株SYPA-ACS的菌株生长与出发菌株SYPA5-5相差不大。当发酵时间培养稳定后，重组菌株SYPA-ACS的菌体量明显高于出发菌株。40～96 h是菌体积累L-精氨酸的重要时期，此时重组菌株SYPA-ACS发酵产酸能力相对出发菌株SYPA5-5优势较为明显，L-精氨酸的合成产量更高。如图7所示，发酵稳定期SYPA-ACS的产量达到53.43 g/L，比出发菌株41.91 g/L，提高了25.72%，产率0.577 g/(L·h)。综上，通过异源表达ACS，增加了乙酸的转化率，不仅利用了乙酸，减少了对细胞生长毒害作用，同时提高了乙酰辅酶A的通量，加强了菌株合成L-精氨酸的能力。

图7 SYPA-ACS菌株 5 L发酵产L-精氨酸性能测定Fig.7 Fermentation performance of L-arginine producing SYPA-ACS strains in 5 L fermenter

3 讨论

本文首先对合成乙酰辅酶A进行筛选，对4种不同ACS编码基因acs进行克隆表达，并且对其酶学性质进行比较。巴氏醋酸杆菌来源的ACS最高活力为784.59 U/mL。ApACS1最适反应pH为7.0，最适反应温度为37 ℃。酶学稳定性实验显示，ApACS1酶活力最高且酶学稳定性更好，因此选择最适来源的ACS在钝齿棒杆菌克隆表达。钝齿棒杆菌中异源表达ApACS1后，在5 L发酵罐发酵培养研究其L-精氨酸生产性能，SPYA5-5和SYPA-ACS的细胞干重分别为24.33和26.09 g/L(图7)，与SPYA5-5相比提高了7.37%，表明过表达ACS不会影响到菌体的生长速率，并能改善菌体生长环境。在发酵后期，SYPA-ACS菌株发酵产酸能力相较SPYA5-5提高27.48%，分别为53.43 g/L和41.91 g/L。相较于重组菌株SYPA-ACS，出发菌株SPYA5-5生长和产酸并没有重组菌株高，其原因由于乙酸的合成，不仅会对细胞产生毒害作用影响菌体生长，还会降低胞内pH，而菌株发酵培养的最适pH为6.5～7.0，且精氨酸的前体物质谷氨酸合成的关键酶——谷氨酸脱氢酶在pH中性条件下酶活力最高。当培养基pH降到6.5左右时，谷氨酸脱氢酶活力下降近一半[21]，不仅影响菌体生长，也不利于细胞进行各项代谢调控合成精氨酸。通过异源表达ACS，能有效利用乙酸转化成乙酰辅酶A，提高代谢途径中的终产物L-精氨酸含量，为L-精氨酸的工业化提供了理论依据和实验基础。