术连饮对腹泻型肠易激综合征模型大鼠脑肠肽的影响

刘蔚雯 张学强 戴燕真 黄 群▲

1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.国药集团汕头金石制药有限公司，广东 汕头 363509

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一种肠道功能紊乱疾病，表现为反复发作的腹痛、腹泻，伴有排便频率改变和大便性状异常[1]。根据罗马Ⅳ标准[2]分为4 种亚型：腹泻型、便秘型、混合型和不定型，在我国以腹泻型肠易激综合征（diarrheal irritable bowel syndrome，IBS-D）最为多见。该病慢性进展，持续或间歇发作，给患者日常生活和心理健康带来极大困扰。现有治疗手段局限于改善症状，缓解病情，却难以根治。IBS-D 在祖国医学中属于“泄泻”“腹痛”等范畴，临床辨证分型为脾虚湿盛型、肝郁脾虚型、脾肾阳虚型、脾胃湿热型等[3]，IBS-D 患者脾虚湿盛型比例高达40%[4]，提示健脾燥湿止泻法在治疗中具有积极意义。前期研究表明[5]，以健脾燥湿法为指导组成的术连饮方，能够改善功能性消化不良大鼠肠运动障碍。本研究通过观察术连饮对IBS-D 大鼠体重、进食量、Bristol 评分、P 物质（substance P，SP）、神经肽Y（neuropeptide，NPY）的影响，探讨术连饮调节脑肠肽的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF 级雄性SD 大鼠40 只，体重（210±20）g，由福建医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（闽）2016-0002。实验过程遵守《关于善待实验动物指导性意见》的原则和要求[6]。根据体重均衡原则，按照随机数表法分为空白组、模型组、匹维溴铵组和术连饮组，每组各10 只。

1.2 药品与试剂

番泻叶（江西樟树天齐堂中药饮片有限公司，批号：1908006），术连饮，即生白术与黄连（黄冈金贵中药产业发展有限公司，批号：D9080101），匹维溴铵片（法国Abbott Laboratories Limited，批号：708624）。SP 抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司，批号：DF6541），NPY 抗体（武汉博士德生物工程有限公司，批号：PB9296）。

1.3 实验仪器

7300 荧 光 定 量PCR 仪（美 国ABI 公 司），Tamon-5200 超高灵敏化学发光成像系统（美国BIO-RAD 公司）。

1.4 造模与模型评价

番泻叶灌胃结合束缚法复制IBS-D 模型大鼠[7]：空白组灌胃20 ml/kg 生理盐水，不做束缚刺激，其余大鼠均灌胃番泻叶水煎液20 ml/kg，2 次/d，灌服1 h 后，用软毛发圈束缚大鼠前肢，并将透明胶带缠绕其肩部与胸部，束缚1 h，连续14 d。

造模后大鼠体形消瘦，束缚时暴躁，易激惹，解除束缚后精神萎靡，喜扎堆倦卧懒动，大便稀溏，肛周及尾部沾染稀便，污浊臭秽。模型组大鼠体重、进食量均减少，Bristol 评分升高，与空白组比较，差异有统计学意义（P＜ 0.05），表明模型复制成功。造模过程中无大鼠死亡。

1.5 给药方法

造模成功后于第15 天开始给药，除空白组外，其余各组继续灌服番泻叶煎液20 ml/kg，1 h后灌胃给药，空白组与模型组均灌胃等体积生理盐水，匹维溴铵组生药18.5 mg/kg，术连饮组生药4.6 g/kg。给药1 h 后，束缚1 h，1 次/d，连续14 d。

1.6 样本采集

于实验第28 天，禁食（不禁水、药）24 h，第29 天以10%水合氯醛麻醉大鼠，腹腔采血后，快速断头取脑，在冰台上分离下丘脑，截取距离大鼠肛缘约6 cm处结肠样本，置于-80℃冰箱保存待测。

1.7 观察指标及评价标准

体重的测定：每周固定时间对各组大鼠称重，观察体重的变化。

进食量的测定：测定各组单只大鼠日平均进食量。每天固定时间添加定量饲料（500 g），24 h 后称取剩余饲料重量。日平均进食量（g）=（加料量-剩余量）/每组大鼠只数。

Bristol 评分：分别于造模前（第1 天）、给药前（第14 天）、给药后（第28 天）进行评分，大鼠分笼单只饲养，自由进食与饮水，收集2 h 内粪便，根据Bristol 分级评分标准[8]进行评分。见表1。

表1 Bristol分级及评分

实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测SP、NPY mRNA 表达：称取下丘脑和结肠组织各50 mg，充分研磨，用Trizol 试剂提取总RNA，取1 μg的RNA 逆转录合成cDNA，将cDNA 产物配置qPCR 反应体系，引物序列由福州铂尚生物有限公司合成。见表2。

表2 引物序列

Western blot 法检测SP、NPY 蛋白表达：采用预冷RIPA 蛋白抽提试剂提取蛋白，按0.1 g 组织加入1 ml 含PMSF 的RIPA 裂解液，充分匀浆，冰浴30 min，4℃离心，12 000 rpm，5 min，吸取上清液，移至预冷离心管中。加入BSA 标准液，检测样品蛋白含量，按1 ∶4 比例加入5×SDS-PAGE loading buffer，水浴加热5 min，以充分变性蛋白。以RIPA调整蛋白浓度，根据目的蛋白分子量，配制5%浓缩胶，电泳，转膜，封闭，一抗、二抗孵育，曝光显影，化学发光成像系统分析。

1.8 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数± 标准差（±s）表示。正态分布数据，组间比较采用单因素方差分析，行t检验，非正态分布数据，使用秩和检验，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组大鼠体重变化比较

造模前各组大鼠体重比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。造模14 d 后（给药前），模型组、匹维溴铵组、术连饮组大鼠体重均低于空白组（P＜ 0.01）；治疗14 d 后（给药后），匹维溴铵组、术连饮组大鼠体重均高于模型组（P＜ 0.01）。见表3。

表3 四组大鼠体重变化比较（g，x ± s）

2.2 四组大鼠日平均进食量比较

造模前各组大鼠进食量比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。造模期（14 d）模型组、匹维溴铵组、术连饮组大鼠进食量均低于空白组（P＜ 0.01）；治疗期（14 d）匹维溴铵组、术连饮组大鼠进食量均高于模型组（P＜ 0.01）。见表4。

表4 四组大鼠日平均进食量比较（g，x ± s）

2.3 四组大鼠Bristol评分比较

造模前各组大鼠Bristol 评分比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。给药前模型组、匹维溴铵组、术连饮组大鼠Bristol 评分均高于空白组（P＜ 0.01）；给药后匹维溴铵组、术连饮组大鼠Bristol 评分均低于模型组（P＜ 0.05）。见表5。

表5 四组大鼠Bristol评分比较（分，x ± s）

2.4 四组大鼠下丘脑和结肠组织SP、NPYmRNA表达比较

模型组大鼠下丘脑及结肠SP mRNA 表达高于空白组，NPY mRNA 表达低于空白组（P＜ 0.01）。匹维溴铵组、术连饮组大鼠SP mRNA 表达均低于模型组，NPY mRNA 表达均高于模型组（P＜ 0.01）。见表6。

表6 四组大鼠下丘脑和结肠组织SP、NPY mRNA表达比较（x ± s）

2.5 四组大鼠下丘脑和结肠组织SP、NPY蛋白表达比较

模型组大鼠下丘脑及结肠SP 蛋白表达高于空白组，NPY 蛋白表达低于空白组（P＜ 0.01）。匹维溴铵组、术连饮组SP 蛋白表达均低于模型组，NPY蛋白表达均高于模型组（P＜ 0.01）。见图1、表7。

表7 四组大鼠下丘脑和结肠组织SP、NPY蛋白表达比较（x ± s）

图1 大鼠下丘脑和结肠组织SP、NPY 蛋白电泳图

3 讨论

随着神经胃肠病学研究的深入，脑-肠互动异常与IBS 发病的相关性日益受到重视。研究表明[9]，IBS 患者给予直肠扩张后，其大脑边缘系统明显活跃，而边缘系统主要负责处理疼痛应激与情绪反应等。由此可见，持续的肠道刺激可引起中枢神经系统（central nervous system，CNS）异常反馈，出现脑-肠互动异常，而脑肠肽作为脑-肠互动的中介，发挥着重要的作用。脑肠肽是一种小分子多肽，在CNS、肠神经系统（enteric nervous system，ENS）及胃肠道均有分布，既可作为神经递质传递信息，亦可作为激素发挥双重作用，与IBS 发病相关的脑肠肽主要有SP、NPY 等。SP 是一种兴奋性脑肠肽，广泛分布于CNS 与ENS 中，许向前[10]实验发现，IBS-D 模型大鼠的十二指肠及下丘脑组织中SP 含量明显升高，SP 的升高能够促进结肠运动，刺激肠黏膜分泌水和电解质，从而引起腹泻。NPY 是一种抑制性脑肠肽，主要存在于中枢、外周神经系统及肾上腺髓质的嗜铬细胞中，在肠神经丛可与周围性乙酰胆碱转移酶相结合，抑制胃肠运动和水、电解质的分泌等；在下丘脑和海马，NPY 可发挥中枢拮抗应激与稳定情绪等作用。研究显示[11]，IBS 患者结肠及下丘脑组织中NPY 的含量低于正常人。马军等[12]研究表明，IBS-D 大鼠结肠组织NPY 蛋白表达显著降低。本研究结果显示，模型组大鼠下丘脑和结肠组织中SP 蛋白及其mRNA 表达升高，NPY 蛋白及其mRNA 表达降低，Bristol 评分明显升高，大便稀软或不成形。经术连饮治疗后，Bristol评分明显降低，稀水便减少或成形。提示术连饮可能通过影响兴奋性和抑制性脑肠肽的分泌，下调SP、上调NPY 表达，使腹泻症状得以好转，达到治疗IBS-D 目的。关于SP 与NPY 之间的信号传导通路研究，将在后续实验中进行深入探讨。

中医学并无“脑肠互动”这一概念，但脑肠相通的整体观早已贯穿于经络与藏象学说之中。脑为奇恒之腑，位居头部，而头为“诸阳之会”，例如足阳明胃经与手阳明大肠经于鼻旁相接，说明头面（脑）与胃肠经络相连，存在着信息交互传递的通道。《医林改错》曰[13]：“灵机记性在脑者，因饮食生气血，长肌肉，精汁之清者，化而为髓，由脊髓上行入脑，名曰脑髓”，王清任明确指出脑主神明，为髓之海，其生理功能的正常发挥有赖于后天之精的充养，而后天之精主要来源于脾胃肠共同作用所化生之水谷精微。若脾失健运，气血生化乏源，以致髓海不充，脑府失养，与肠腑之互动失衡；且脾虚易于生湿，湿郁化热，下注大肠，肠腑传化失司，升降失常，则见泄泻。上述所论可知，脾虚与湿盛是IBS-D 病机的两个主要方面，治当以健脾燥湿，清肠止利立法。术连饮由白术、黄连组方而成，《医学衷中参西录》曾谓[14]：“白术，性温而燥，气不香窜，味苦微甘微辛，善健脾胃，消痰水，止泄泻”。《神农本草经》记载黄连“主肠澼腹痛下痢”[15]，《本草正义》亦云：“黄连大苦大寒，苦燥湿，寒胜热，能泄降一切有余之湿火”[16]。方中生白术、黄连之比为4 ∶1，重用白术为君，功擅健脾燥湿止泻；辅以黄连，善清脾胃大肠湿热，一则助君药燥湿止痢；二则清湿郁所生之热；三则苦寒以制白术之温，而无助热之虞，且黄连之降泄与白术之升清，可调气机之升降，是臣药而兼佐药之能。合而用之，共成补清兼顾，升降同调之剂，使脾虚得健，湿去热清，而泄利自止。