肺移植术后真菌感染诊断的研究进展

2022-11-19刘嘉茜王春新南京医科大学南京11166南京医科大学附属无锡人民医院医学检验科江苏无锡1403

临床检验杂志 2022年8期

刘嘉茜，王春新(1. 南京医科大学，南京 11166；. 南京医科大学附属无锡人民医院医学检验科，江苏无锡 1403)

随着科学技术发展和人类生活水平的提高，肺移植对于大部分慢性肺部疾病患者的治疗越来越有效。在世界范围内，每年约有100名儿童和4 500名成人进行肺移植[1]。很多患者进行肺移植后，面临着发生原发性移植物功能丧失(primary graft dysfunction, PGD)[2]、感染、移植后免疫功能障碍等并发症的风险。而感染性术后并发症的发病率和归因在移植术后的各个阶段都占据首位[3]。肺移植术后真菌感染的风险因素可分为内在和外界因素，内在因素如免疫功能低下、宿主防御系统损害、受者结构异常，外界因素如患者住院时间延长、呼吸机或导管留置时间延长、与ICU环境的频繁接触等，都使得患者容易被真菌等微生物病原体感染。本文对肺移植术后真菌感染的特点及影响，特别是实验室诊断方法的应用价值、优劣及发展前景作一综述。

1 肺移植术后真菌感染特点及影响

肺移植术后真菌感染的发生和类型取决于以下几个因素：物理或功能性免疫抑制的强度、移植后的时间、抗菌预防的类型、移植前定植病原体的存在等[4]。肺移植术后真菌感染与其他真菌感染的区别在于以下方面。(1)感染风险更大：肺移植受者与其他患者相比，自身的组织结构异常以及术后自身的微生物清除机制受到损害，导致真菌感染的概率大幅上升。研究表明，真菌病原体在鼻窦和肺实质的定植与肺移植后侵袭性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)的发生率增加有关[5]。同时肺移植患者由于免疫抑制剂的使用，免疫抑制状态的持续虽然一定程度上避免了异体排斥反应的发生，却并不利于真菌感染的预防与治疗。(2)诊断与治疗的不同：真菌感染后出现的症状不典型使得诊断变得困难，需要无创生化标志物等进行辅助诊断。同时肺移植受者由于围手术期置入深静脉导管、动脉导管、体外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation，ECMO)等，肺移植患者治疗方案也有所影响。肺移植术后早期感染常见于气道感染和移植肺的侵袭性感染[6]，特别是在实体器官移植后的第一年，侵袭性真菌病(invasive fungal diseases, IFDs)显著增加了肺移植受者的死亡率。在真菌病原体中，主要的威胁是烟曲霉，分离率为3%～44%[7-9]，相应死亡率高达41%～51%[10]；其次是念珠菌感染(23%)[11]，最常见的为白念珠菌、隐球菌属[9]，毛霉属高达3%[9,11]；其余还有地方性真菌病(组织胞浆菌)、芽生菌、球孢子菌(1%)[9]、孢子菌(3.5%)[11]、耶氏肺孢子菌(2%)[9]以及皮炎外瓶霉(个案报告)[12]。曲霉感染是术后早期常见并发症，高发期集中在移植后的3个月内。曲霉感染可分为支气管感染、吻合口感染、侵袭性肺部感染和全身播散性感染，其中，75%为支气管或吻合口感染，严重者可引起支气管吻合口瘘等；18%为侵袭性肺部感染；7%为全身播散性感染。烟曲霉感染最常见(占91%)，黄曲霉和黑曲霉感染发生率均为2%，不同种类曲霉混合感染达5%[13]。

2 肺移植术后真菌感染实验室诊断方法

真菌感染的呼吸道表现主要为真菌性肺炎、侵袭性疾病或局部吻合口感染。其中，侵袭性肺部真菌感染的典型表现为发热、胸痛、呼吸困难、咳嗽和咯血，病原体可扩散到其他器官，进展为真菌血症和全身感染。根据我国肺移植术后真菌感染的诊断标准[14]，患者典型体征、痰液性状以及实验室、影像学检查可为曲霉感染的确诊提供依据。其中，实验室检查主要为真菌(1,3)-β-D葡聚糖试验(G试验)、半乳甘露聚糖试验(GM试验)以及痰培养检测，阳性可辅助诊断曲霉感染，也可与其他真菌感染相鉴别。支气管镜检查也可从吻合口曲霉感染病灶中获取标本进行培养和组织病理学检查。

然而，传统的真菌感染诊断方法也存在许多局限性。真菌培养是诊断真菌感染的金标准，但培养过程耗时较长，限制其早期诊断价值。念珠菌和隐球菌培养需要24～48 h，曲霉和根霉培养需要48～72 h。显微镜检查虽然快捷方便，但采样限制较多，检出率较低，尤其是对深部真菌感染的诊断。质谱分析血清中真菌代谢物也是一种新方法，但其检测设备比较陈旧及昂贵。而一些罕见感染，如丝孢菌病、毛孢菌病、暗丝孢菌病、镰刀菌病和隐球菌病等，此类菌种诊断尤其具有挑战性，容易延误最佳治疗时机。由于大多数不常见的真菌感染和诺卡菌病也可能有肺外病灶，如典型的大脑或皮肤受累，这使得诊断更加困难[15]。

在实际临床中，对于没有典型危险因素或病情不稳定的危重病人而言，由于免疫功能低下导致症状的非特异性以及影像结果的不典型性，所以研究重点已经放在无创生化标记物上，可作出快速且精准诊断。以下列举肺移植受者常见检测真菌的实验室诊断方法。

2.1GM试验半乳甘露聚糖是曲霉属的主要细胞壁成分，在真菌复制过程中释放。目前主要使用酶免疫分析法(enzyme immunoassay，EIA)检测半乳甘露聚糖。2019年美国胸科协会指南[16]建议：对怀疑为侵袭性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)的不明原因肺部浸润且严重免疫功能低下患者使用血清GM检测。强烈建议对血清GM阴性但有强烈IPA危险因素的患者或血清GM阳性但有假阳性结果混杂因素的患者进行支气管肺泡灌洗液GM检测[17]。血清GM和支气管肺泡灌洗液GM均可诊断中性粒细胞减少患者的侵袭性曲霉属或相关霉菌，血清GM对严重中性粒细胞减少症患者的IFI诊断具有最高的敏感性[4]。但在非中性粒细胞减少患者中，血清GM敏感性较低，可用支气管肺泡灌洗液GM进行辅助诊断。GM实验的局限性体现在：可与其他霉菌发生交叉反应，且青霉素类抗菌药物可导致GM假阳性等。

2.2G试验 (1，3)-β-D葡聚糖包含在大多数真菌的细胞壁中，肺部真菌感染患者在免疫系统的作用下细胞壁水解，所以大部分的肺部真菌感染患者体内(1，3)-β-D葡聚糖含量高于健康志愿者以及其余病原菌导致的肺部感染患者[18]。G试验作为IFDs的筛查方法，其诊断敏感性和特异性分别为75% (95%CI：64%～84%)和87%(95%CI：81%～92%)[19]。

G试验也存在局限性。在接受输血或静脉注射免疫球蛋白的患者以及接受血液透析的患者中，G试验可能存在假阳性结果；毛霉和隐球菌不会引起结果升高，不应作为IFDs的独立诊断试验。与GM试验类似，细胞壁靶向抗真菌预防或治疗对G试验检测敏感性的影响尚不清楚，有待进一步研究。G试验、GM试验联合检测可起到互补作用，从而提高诊断IFI敏感性和准确性[20]。

2.3T2 Candida panel T2公司所研发的念珠菌检测面板T2 Candida panel是一种有效的诊断和抗菌管理工具，也是美国食品药物管理局(U.S. Food and Drug Administration，FDA)批准的唯一检测全血样本中念珠菌属的试验。试验需取全血作为样本，在第一次抽血后的3～5 h内提供菌种鉴定，且不依赖于阳性血培养，通常在第二剂抗菌药物给药前进行，更快速、更准确，有着很好的应用前景。T2 Candida panel结合PCR技术扩增DNA，并通过扩增子诱导的超磁性粒子凝聚和核磁共振检测扩增产物，可用于高危患者的检测，并减少不必要的抗真菌药物使用[21]。一项针对念珠菌血症住院患者的多中心试验发现，在念珠菌感染率为10%的情况下，T2 Candida panel的敏感性为89%，阳性预测值为84%[22]。对于可疑的侵袭性念珠菌病，若结果为阴性，应谨慎解释阴性结果，并考虑不包括在该检测面板中的菌种[21]；若结果为阳性，为避免假阳性应进行血液培养，以证实T2 Candida panel结果。

2.4PCR检测 PCR法与传统真菌培养法相比，具有操作简易、检测周期短、敏感性更高的优点，有利于抗真菌治疗药物的选择。如曲霉PCR检测，方法因DNA提取方案、扩增技术、阳性阈值和标本类型而异，目前还没有普遍接受的检测曲霉属的方法。许多关于曲霉PCR的研究都是针对恶性血液病患者侵袭性曲霉病的检测或早期诊断，因此对肺移植人群的适用性尚不清楚。毛霉 PCR目前临床上不可用，且抗真菌药物的应用会显著降低检测敏感性。PCR检测的局限性是只能判断标本是否有真菌，但不能确定是否是致病真菌，也不能确定是活菌还是死菌，同时也不能对抗真菌药物的敏感性和耐药性进行检测[23]。研究表明，定量PCR检测联合G试验、GM试验能够明显提高IFI临床检测准确性[24]。因此，检测应该结合其他实验以及患者的临床症状及影像学特征作出综合判断。

基于PCR开发的一系列分子诊断方法，主要对真菌保守序列或特异性基因片段进行扩增和检测，其特异性随引物设计和样品纯度的不同而不同。如外周血非编码RNA在疾病发生发展过程中变化迅速，对其进行综合分析可敏感地反映微环境的动态变化，帮助临床更精确地诊断。RNA相关检测面板检测指标的表达稳定，不受免疫抑制剂等药物的影响；可以在感染的早期阶段检测到，特别是在感染相对有限的时候；只需少量外周血标本即可快速准确诊断，便于临床应用[25]。

2.5二代测序技术(next-generation sequencing technology, NGS) NGS检测作为目前病原微生物研究领域应用最为广泛的测序手段，与传统的测序方法相比，具有通量高、测序速度快、运行成本低和准确性高等优点，特别是在真菌、病毒感染病例中具有显著性优势。NGS不需要靶特异性引物，在单次序列测定中可确定菌株基因组完整的DNA序列，可用于所有病原体的鉴定和分型，测序时间一般不超过48 h，最快可以在8 h内实现从DNA样本建库到数据分析获取全过程。Roche公司的454 FLX、ABI公司的SOLID测序技术和Illumina公司的Solexa技术[26]等均是比较成熟的NGS平台。

2.5.1Roche 454 FLX 是一种依靠生物发光进行DNA测序的新技术，是一种基于焦磷酸测序原理而建立的高通量基因测序系统。优点在于快速、准确、灵敏度高和自动化，重复序列少。每个测序反应都在PTP板上独立的小孔中进行，因而能很大地降低相互间的干扰和测序偏差，读取长度相比于Illumina公司产品更长，高达400 bp。缺点在于成本耗费较大，通量较低，无法精准测量同聚物的长度，可能会引入插入和缺失错误。该平台适用于从头测序、宏基因组测序、序列拼装和获得新基因。但由于技术的更新和市场的发展，目前并不常用。

2.5.2ABI SOLID 使用基于磁珠的大规模并行连接测序平台，连接反应的底物是荧光标记的8碱基单链DNA探针。SOLID测序具有高通量、高准确度、易区分单核苷酸多态性和测序错误等优点，主要的缺点是读长较短，运行较慢，常用于外显子测序、基因突变测序等。由于市场和公司等原因，目前该测序技术也并不常用。

2.5.3Illumina Solexa 是单分子阵列测序，边合成边测序，其核心为桥式PCR和可逆末端终止。优点在于测序快、低错误率、低成本、应用范围广，很好地解决了同聚物的测定问题。主要缺点是读长较短，后续拼接工作的计算量和难度很大。目前适用于RNA测序和表观遗传学研究。

虽然NGS相较于传统检测方法有许多优势，但是目前并不能完全取代传统方法，仍存在一些实际问题：缺乏标准化的数据处理及分析流程，缺乏统一准确的对照数据库等。此外，针对支原体、衣原体、军团菌等胞内感染致病原和真菌等厚壁微生物，NGS的DNA提取效率低，序列数和覆盖率偏低，最终导致检测敏感性下降[27]。通过优化NGS检测技术和条件，将传统和新型检测方法相结合，可以进一步提高临床准确率。