新型冠状病毒核酸检测质量控制物质研究及应用进展*

陈颖玮，赵冉，王雪亮(上海市临床检验中心质控品研发实验室，上海 200126)

新型冠状病毒(以下简称新冠病毒)被国际病毒分类委员会命名为SARS-CoV-2，属于冠状病毒科β冠状病毒属，是一种有包膜的正单链核糖核酸(RNA)病毒，会引起严重的呼吸道感染[1]。自2019年12月被报道以来，新冠病毒及其多个“需关切突变株”(variants of concern，VOC)，如阿尔法、德尔塔、奥密克戎等，在全球范围内的感染人数已超过4亿，其中包括近600万的死亡病例[2]，且该人数仍在持续增长中。

为有效控制疫情，需采取便捷可靠的筛查方式，以及时发现传染源并切断疫情传播途径。实时荧光PCR因具有灵敏度高、特异性强、检测周期短、可自动化、高通量批处理等优点，被认为是新冠病毒检测的金标准[3-4]。实时荧光PCR的关键步骤包括核酸抽提、逆转录、扩增等，任何一个环节出现问题都会影响其检测质量。为有效保证核酸检测质量，需要借助于能评价检测系统性能或监测实验室检测结果重复性和准确性的质量控制物质，如标准物质和质控品等。目前在临床中使用的新冠病毒核酸检测质量控制物质分为阴性和阳性质量控制物质。阴性质量控制物质形式较为简单，如《新型冠状病毒肺炎防控方案(第九版)》(联防联控机制综发〔2022〕71号)中要求实验室使用生理盐水作为阴性质量控制物质，以监测实验室可能出现的假阳性情况。而阳性质量控制物质形式多样，主要包括患者样本、病毒培养和人工制备物质等类型。本文对新冠病毒核酸检测阳性质量控制物质的不同种类及应用情况进行介绍，以期为新冠病毒核酸检测质量控制物质的合理选用提供参考。

1 患者样本

患者样本是临床常用的质量控制物质之一，可经临床确诊的新冠患者鼻咽拭子、灌洗液等样本灭活稀释制备而成。此类型样本作为质控品，可监控检测结果的精密度，特别是在缺乏商品化质控品的情况下。如Görzer等[5]在奥地利新冠病毒核酸检测室间质量评价(external quality assessment，EQA)中使用3个100倍稀释的口鼻拭子样本，而后在第3次EQA中，又使用B.1.1.7突变株在内的2个患者样本[6]，对于监测实验室检测结果的准确性起到了重要作用。

患者样本具有与临床样本一致的组成成分，可真实地反映实际检测情况，使得检测结果更具有说服力。但由于其自身成分复杂，可能存在生物安全方面的问题，加之患者阳性样本难以获取，这在一定程度上限制了其临床应用。

2 病毒培养样本

病毒培养样本是将新冠病毒经细胞(如Vero E6细胞)培养、纯化灭活处理后得到可用作质量控制物质的样本。Baronti等[7]采用Vero E6细胞培养2020/FR/702新冠病毒，用蔗糖作为稳定剂，将收获病毒冻干分装后可作为标准物质供临床使用。Matheeussen等[8]使用经数字PCR定量的新冠病毒培养样本开展EQA活动，发现部分实验室对低浓度样本检出率较低，为相关实验室后续提升检测质量提供了建议。Sung等[9]在韩国组织的EQA中采用Vero细胞培养的新冠病毒模拟上呼吸道样本，要求报告假阴性的实验室采取额外纠正措施并参与后续EQA，对实验室发现检测中存在的潜在问题和持续质量改进起到推进作用。

培养病毒的样本具有完整的病毒结构，也是较为理想的质量控制物质类型。但由于病毒培养需在三级生物安全实验室中展开，且需经灭活处理，这也增加了其生产与使用的局限性。

3 人工制备的样本

3.1质粒样本 质粒是存在于染色体外的遗传物质，能独立复制并表达携带的遗传信息，是常用的载体类型。常见质粒制备方式是将外源基因片段插入载体，转染感受态大肠埃希菌增殖表达，经过纯化可获得含有目的片段的质粒[10]。质粒生产工艺成熟，稳定性好，易于构建，能够准确定量，且可通过测序得到准确的碱基序列，是商品化核酸检测试剂盒中最为常见的质控品类型[11]。然而，高浓度质粒容易造成环境气溶胶污染。Mascuch等[12]报道实验室在研制新冠病毒核酸检测试剂过程中发现在处理质粒的实验室以及相邻实验室物表上有阳性质粒污染。

质粒易于制备且方便定量，可被用于评估新冠病毒核酸检测方法或试剂性能，如检测下限的确定、标准曲线绘制、重复性检测等。但质粒与实际病毒样本相差较大，需要添加额外基质样本以更好地模拟临床样本，如阴性唾液样本。此外，质粒也无法监控核酸抽提过程以及RNA逆转录过程。因此，作为广泛应用的商品化质控品类型，质粒仍存在较大不足。

3.2体外转录的RNA样本 体外转录是指在体外模拟体内转录过程，通过RNA转录酶合成RNA片段。如将合成的新冠病毒靶标DNA片段构建入含有T7启动子的载体中，利用T7 RNA聚合酶进行体外转录可得到相应的RNA片段[13-14]。体外转录的RNA使得RNA量产变为可能，可作为质量控制物质来保证诊断试剂的准确性。

体外转录的RNA常被用于新冠病毒核酸检测试剂方法学性能验证，如将体外转录的RNA标准物质用于新冠病毒核酸定量[15]，或用于最低检出限研究[16]。体外转录的RNA也是常见的新冠病毒标准物质类型，美国国家标准和技术协会、欧盟委员会联合研究中心、中国计量科学研究院和上海市计量测试技术研究院等多家研究机构均可提供体外转录RNA形式的标准物质。

体外转录的RNA不仅易于批量制备，还可弥补质粒无法监控RNA逆转录步骤的不足，从而更好地监测PCR检测全过程[17]。但是，体外转录的RNA依然无法监测病毒RNA的抽提过程。此外，体外转录的RNA稳定性较差，需通过优化保存剂来保证其不发生降解[13]，对存储运输条件也提出了更高要求。

3.3病毒抽提的RNA样本 从新冠病毒中抽提得到的RNA具有完整的新冠病毒基因组信息，常被用于标准物质或质控品等质量控制物质的制备。本研究组将病毒抽提RNA制备的新冠病毒标准物质倍比稀释，用于评估14种常规新冠病毒检测试剂和3种快检试剂的检测灵敏度，发现不同检测试剂间最低检出限可相差8倍[18]。此外，本研究组也曾使用病毒抽提的RNA作为EQA质控品，发现部分实验室存在低浓度样本检出率不太理想的情况[19]。然而，与体外转录RNA相似，病毒抽提的RNA样本也存在不能监测核酸抽提过程、稳定性较差的问题。

3.4噬菌体假病毒颗粒 噬菌体MS2的外壳蛋白CP、成熟酶蛋白A和包装位点PAC可以自行组装形成噬菌体病毒样颗粒，并将PAC下游的外源RNA包装到外壳蛋白内[20]。使用该技术制备的质量控制物质在形态结构上与天然病毒颗粒相似，由于缺乏完整的病毒核酸，无法进行独立复制，可有效减少生物安全性的问题。Wang等[21]将覆盖EQA试剂检测靶点的部分ORF1ab基因、N基因和E基因序列插入到pACYC-MS2载体中，制备了4个浓度的样本用于EQA。

MS2病毒样颗粒无感染性且复制缺陷，遗传物质由蛋白质外壳包裹，弥补了体外转录RNA无法监测病毒RNA抽提的问题，从而做到全过程监控。此外，外壳蛋白的包裹可使其耐受核酸酶降解，因而具有较好的稳定性。然而，由于MS2病毒样颗粒对外源片段的包裹能力有限，导致其无法一次性包裹较长外源基因片段，如新冠病毒ORF1ab基因，因而往往需要制备多个假病毒颗粒，混合后作为质控品使用，增加了操作的复杂性。因此，在选用此类质量控制物质时，应确认噬菌体假病毒颗粒所包含的基因片段能覆盖检测试剂的扩增区域，以有效用于实验室检测系统中。

3.5慢病毒 慢病毒载体是一种复制缺陷病毒载体，能够将外源基因整合到宿主染色体上得到表达[22]。此种方式也用于制备质量控制物质，如中国计量科学研究院将新冠病毒N基因、E基因和ORF1ab基因片段克隆至慢病毒载体pCDH上，转染细胞后获得带有相应目的片段的慢病毒颗粒，可作为新冠病毒核糖核酸标准物质[23]。Lee等[24]也通过pCDH载体制备了含有RdRp基因、N基因、E基因和S基因片段的慢病毒，并使用数字PCR定量，可作为标准物质用于RT-qPCR、二代测序、等温扩增和CRISPR检测方法中。相较于噬菌体假病毒，慢病毒能整合较大的外源DNA，但目前对于其安全性仍会有一定的担忧，常需要通过使用复制缺陷的慢病毒载体、插入额外的停止子和热灭活来确保其生物安全。

3.6其他 此外，也有其他一些人工制备的样本用于新冠病毒质量控制物质的制备，如在疫苗制备中广泛应用的甲病毒。东京都政府在2020年7月组织的EQA中使用了甲病毒制备的新冠病毒质控品[25]。此外，Chan等[26]开发了基于噬菌体Qβ和植物病毒豇豆褪绿斑驳病毒(CCMV)的带有新冠病毒基因片段的病毒样颗粒，可作为新冠病毒核酸检测质控品。

4 总结

在新冠病毒核酸检测中，人员操作误差、仪器设备未及时校准或故障、试剂质量等因素都会影响检测质量[14]。因此，必须采取严格的质量控制措施，而性能可靠的质量控制物质的应用是其中重要一环。本文内容揭示了不同类型的质量控制物质具有各自不同的优缺点，应根据实际应用场景进行合理选择。当前，研发一种更易于制备、生物安全风险低、稳定可靠、可监控反应全程的理想新冠病毒核酸检测质量控制物质仍是业内从业人员的研究热点。此外，由于新冠病毒核酸检测技术的广泛应用，临床分子检测平台不断完善，更多的分子检测技术将在临床加速开展。为保证相关项目检测结果的准确可靠，这对分子检测质量控制物质提出了更高要求，而新冠病毒核酸检测质量控制物质的应用也将为其他相关分子检测项目质量控制物质的研发和选用提供参考借鉴。