程序性坏死在肾纤维化中的研究进展

周贤，李六生

（三峡大学人民医院肾内科，湖北 宜昌 443000）

0 引言

众所周知，肾纤维化是各种慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）发展致终末期肾病的最终共同途径，病理表现为肾小管萎缩、间质纤维化和肾小球硬化。既往研究表明，肾小管间质纤维化与炎症、细胞死亡、细胞外基质增殖和上皮间充质转化等因素有关[1]，组织损伤和无菌性炎症是肾纤维化进展的重要触发因素，损伤后坏死细胞释放损伤相关分子模式（Damage-associated molecular patterns,DAMPs），导致与坏死相关的无菌炎症反应[2]。然而，潜在的分子机制尚未确定，尚缺乏有效的治疗方法。因此，深入探讨肾纤维化发生的机制，寻找新的治疗靶点，对于降低CKD的发病率具有重要的意义。近年的研究发现，程序性坏死在肾纤维化中发挥重要的作用，目前成为肾脏病领域研究的热点。本文就近年来程序性坏死在肾纤维化中的作用机制以及程序性坏死作为抗肾纤维化治疗靶点的研究进展进行综述，为肾纤维化的防治提供新的思路。

1 程序性坏死的发生机制

程序性坏死是一种新的、不依赖于半胱氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)的调节性细胞死亡类型，其主要特征是细胞肿胀和细胞膜破裂。程序性坏死涉及受体相互作用蛋白 激 酶1（Receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）和受体相互作用蛋白激酶3（Receptorinteracting protein kinase 3，RIPK3）以及下游底物混合系列蛋白激酶样结构域（Mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）。当RIPK1磷 酸 化RIPK3后，磷酸化的RIPK3激活MLKL，最终导致质膜破裂并将促炎细胞内容物释放到细胞外空间[3]。有研究报道，RIPK3/MLKL介导的程序性坏死可以导致肾小管间质损伤和肾脏缺血-再灌注损伤相关的间质纤维化[4,5]。程序性坏死受多种细胞内、外刺激调控，包括肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)家族成员、自杀相关因子（Factor associated suicide，Fas）配体、干扰素、氧化应激等。尽管Fas和TNF相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）受体都以与caspase介导的凋亡相关而闻名，但有研究表明，尽管应用caspase抑制剂，细胞死亡仍会发生[6]。为了了解程序性坏死的相关机制，TNF-α诱导的程序性坏死是最广泛的途径。程序性坏死途径受RIPK1和RIPK3以及MLKL的调控。在与死亡受体TNF受体1 (TNFR1)结合后，相继招募各种下游分子。RIPK1通过受体相互作用蛋白招募RIPK3，RIPK1和RIPK3磷酸化，然后通过苏氨酸357和丝氨酸358位点的磷酸化激活MLKL[7]。p-MLKL通过与质膜中的磷脂酰肌醇磷酸结合，引起膜通透性改变，诱导细胞外钙内流和质膜穿孔，导致程序性坏死[8]。随后，损伤相关分子模式(Damage-associated molecular patterns,DAMPs)，如高迁移率组盒1、热休克蛋白和线粒体DNA被释放，这些细胞外释放的DAMPs可激活浸润性免疫细胞，随后释放细胞因子，促进炎症反应[9]。

2 肾纤维化

肾纤维化不仅是各种进行性慢性肾脏疾病的标志和共同途径，也是肾功能不全的主要决定因素和可靠的预后指标，主要表现为硬化、肾小管萎缩和肾间质纤维化[10]。CKD以肾脏结构受损、功能下降为特征，是由炎症、代谢紊乱、毒物等因素引起的一组常见的慢性疾病。随着人口老龄化和糖尿病、高血压的增加，CKD的患病率不断上升，约占成人人口的10%-13%[11]。不同程度的CKD有不同的初始进化，这与其病因的多样性(如遗传、性别、自身免疫相关感染、环境因素、饮食和药物)有关[12]。肾脏疾病中受损的肾实质细胞通常因病因而异。当发病机制为肾小管中毒、梗阻、缺血等时，首先受到损伤的是肾小管上皮细胞，然后发生肾间质纤维化[13]。相当多的患者最终发展为终末期肾病，需要终生透析或肾移植。此外，在CKD发生的慢性损伤过程中，肾组织在实质内形成瘢痕，肾脏结构发生破坏，最终破坏肾功能。纤维化降低了自我修复的能力，最终导致肾衰竭。本质上，肾纤维化的形成被认为是各种肾损伤愈合失败的过程。肾脏受到损伤后，激活多种细胞，包括内皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、肥大细胞等渗透性细胞启动进化保守的损伤修复防御程序来抵抗损伤[14]。虽然肾纤维化的病因多种多样，但其发生机制是相同的。肾小管间质纤维化的形成主要由四个部分组成：肾损伤后炎症反应的激活和炎症细胞的浸润、前成纤维细胞的释放、成纤维细胞的活化和扩增导致大量ECM沉积和肾结构和功能受损，肾小管萎缩，微血管减少[15]。每一个病理过程都能以其独特的方式导致纤维化的进展，共同构成一系列核心纤维化事件，最终导致肾实质的破坏和肾功能的丧失。肾纤维化是威胁人类生命和健康的严重问题，至今仍缺乏有效的治疗策略。因此，人们开始关注肾纤维化发生发展的机制，寻找有效的干预策略，这也是现阶段克服该疾病的重点和难点。

3 程序性坏死与肾纤维化

3.1 程序性坏死介导的炎症反应与肾纤维化

不受控制或过度的炎症可导致进行性肾损伤，这也被认为是肾纤维化的初始阶段。在糖尿病肾病、败血症引起的急性肾损伤、单侧输尿管梗阻（Unilateral Ureteral Obstruction，UUO）模型中，坏死的肾小管细胞通过释放组蛋白、热休克蛋白等损伤相关分子模式触发肾实质细胞信号通路的激活来驱动炎症反应[16]。程序性坏死导致细胞质膜破裂以致细胞因子释放、血管通透性增加，形成无菌性炎症。细胞坏死和坏死相关的免疫激活加速了坏死性炎症。坏死性炎症可通过少量坏死细胞启动先天免疫系统，随后诱导更多细胞坏死触发更强的炎症反应，最终可能导致整个器官衰竭[17]。在这一病理过程中，缺血、毒素和白蛋白尿可引起小管间质炎症，而小管间质炎症可引起肾小管上皮细胞损伤，加重小管间质炎症。它在肾小管上皮细胞损伤和炎症之间形成了一个循环。调节这种平衡可能对抑制肾纤维化的发展至关重要。根据以往的研究，细胞坏死的发生是由受体和感受器通过不同的刺激介导的，如肿瘤坏死因子受体、干扰素受体，这些可导致激活后坏死体的形成。死亡细胞释放的DAMPs可以通过包括炎症小体模式识别受体激活先天免疫反应，也可以诱导肾实质细胞和炎症细胞炎症反应[18]。DAMPs调节小管损伤和小管间质炎症，阻断DAMPs似乎是缓解肾脏损害进展的一种策略。

肾脏细胞死亡和无菌性炎症是肾纤维化的主要机制，最终可发展为终末期肾病。在临床肾移植中，肾纤维化和肾小管萎缩区域的炎症与慢性肾小球病变以及肾功能下降有关[19]。研究发现，慢性肾纤维化患者与肾移植后恢复良好的患者相比，RIPK3表达上调。通过对RIPK3过表达后的程序性坏死相关指标进行检测，发现RIPK3和MLKL的磷酸化水平明显升高，乳酸脱氢酶释放水平升高。在程序性坏死过程中，细胞可以释放损伤相关的分子模式，这些分子可以在没有感染的情况下引发炎症反应[20]。加入程序性坏死MLKL抑制剂（Necrosulfonamide,NSA）后，炎症反应明显减轻[21]。活性氧（reactive oxygen specie，ROS）是指需氧细胞产生的氧的某些代谢产物和一些反应的含氧产物,ROS是细胞损伤的重要介质，脂质过氧化是ROS诱导的氧化应激的最重要原因[22]。研究表明过表达RIPK3后，ROS的产生显著增加。去除过量的ROS后，程序性坏死和炎症均在很大程度上恢复。这些结果表明ROS与程序性坏死和炎症密切相关。核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）是一种转录因子，调节多个基因的表达水平，并控制各种细胞功能，包括炎症和坏死信号传导[23-24]。RIPK3过表达可有效激活NF-κB信号通路，且该激活可被ROS清除剂N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acety,NAC)显著抑制，提示ROS是NF-κB通路中的重要介质。随后，用NF-κB抑制剂处理细胞，发现细胞坏死和RIP3诱导的炎症反应也受到抑制。总的来说，这些结果表明程序性坏死是通过依赖于ROS的NF-κB通路诱导炎症的[25]。总之，CKD患者出现肾纤维化，可能的机制是程序性坏死的激活导致炎症反应，并最终导致患者肾纤维化的形成。

3.2 程序性坏死与肾纤维化信号通路TGF-β1

转化生长因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)是调控肾纤维化的关键因子，根据靶细胞类型和微环境可诱导不同的细胞应答反应。TGF-β在多种组织的炎症、增殖、分化和愈合中发挥多种稳态调节作用。许多研究表明，TGF-β刺激成纤维细胞的活化和增殖，导致细胞外基质沉积。其表达的增加可导致许多纤维化疾病，其表达水平往往与疾病的严重程度相关。在此基础上，抑制TGF-β及其活性在治疗各种纤维化疾病如肺纤维化、肾纤维化、系统性硬化等方面具有巨大的治疗潜力。通过了解TGF-β信号转导和活性的分子机制，研究者可以制定不同的策略来调节TGF-β的活性。许多小分子抑制剂已被开发用于抑制TGF-β受体的胞质结构域和细胞内信号分子。在哺乳动物中已发现TGF-β的三种亚型，包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3[26]。为了将TGF-β复合物切割成活性成分并释放活性TGF-β，需要一种或多种多种蛋白酶，包括纤溶酶、基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9、血栓反应蛋白、整合素和甘露糖6磷酸受体[27]。过度表达活跃TGF-β1可诱导包括肾脏在内的多个器官的纤维化反应，这已被广泛接受。TGF-β1直接或间接作用于各种细胞类型，是小管间质纤维化发病机制中的关键介质[28]。TGF-β1的直接作用包括细胞向成纤维细胞表型的转化和合成成纤维蛋白，如胶原和纤维连接蛋白[29]。TGF-β1也促进间接纤维化反应，通过加速驻留健康细胞的凋亡，促进驻留细胞和浸润细胞增加ECM沉积[30]。在肾纤维化动物模型中抑制TGF-β1可减弱成纤维细胞活化和ECM积累[30]。TGF-β1的中枢信号转导是由两个特异性受体介导的，即TGF-β Ⅱ型受体、和TGF-β Ⅰ型受体。

TGF-β在纤维化组织中被诱导激活，并与多种不同器官纤维化的发病机理有关[31]。TGF-β1水平升高与CKD病情进展及肾间质纤维化相关,并可作为CKD患者肾纤维化病情诊断的预测指标[32]。Imamura等 人[33]的研究 表 明，在UUO肾纤维化模型中，RIPK3缺乏可以延缓肾纤维化。IL-1β，NLRP3炎 症 小 体 可 加 强TGF-β1的 转录[34]。RIPK3可 以 调 控NLRP3炎 症 小 体[35]，在RIPK3信号通路中，促进NLRP3炎症小体激活的触发机制尚不清楚。在使用肾成纤维细胞的体外研究中，RIPK3抑制剂GSK’872或RIPK1抑制剂（necrostatin-1，Nec-1）消除了TGF-β依赖的细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）和α-平滑肌肌动蛋白的表达[33]，表明坏死小体（RIPK1/RIPK3）是TGF-β在刺激ECM沉积和成纤维细胞激活中的下游调节因子。坏死小体-依赖的ATP柠檬酸裂解酶通路此前已被确定为TGF-β下游。TGF-β活化激酶1 (TAK1)与TGFβ1相互作用，通过TGF-β1/TAK1/MKK3/p38MAPK、TGFβ1/TAK1/MKK4/JNK和TGF-β1/TAK1/ NF-κB信号通路促进器官纤维化的发生发展[36]。上述研究提示，肾纤维化中患者TGF-β下游通路激活，程序性坏死标记物升高，表明程序性坏死和TGF-β介导的通路参与了肾纤维化的形成。

3.3 程序性坏死抑制剂与肾纤维化

抗肾纤维化治疗是防治CKD的重要措施，针对下游TGF-β1信号通路来预防肾脏疾病不太可能是有效的，开发靶向性更强的下游通路的阻断剂，如程序性坏死通路抑制剂可能更有益[37]。到目前为止，已经研究出几种小分子化合物可以抑制RIPK3活性[38]。这些RIPK3的抑制剂可以分为三种类型:以位于两个催化结构域之间的ATP结合活性位点为靶点的ATP模拟抑制剂、以非激活状态为靶点抑制剂及未分类的抑制剂[39]。GSK’872是RIPK3选择性激酶中应用最广泛的细胞渗透性抑制剂，并已被用于特异性抑制RIPK3[40]。丝氨酸/苏氨酸激酶B-Raf V600E抑制剂是唯一获得批准使用的RIPK3抑制剂[41]。总之，抑制程序性坏死是一种很有前途的抗肾纤维化策略。RIPK3刺激TGF-β1下游活化级联，并通过NLRP3炎症小体激活调控TGF-β1转录。近年的研究发现，氟非尼酮可改善肾纤维化和相关炎症[42]。采用UUO诱导小鼠肾小管间质纤维化，同时给予氟非尼酮或Nec-1后，氟非尼酮和Nec-1改善了肾小管损伤、炎性细胞浸润和胶原沉积，并降低了促炎因子（IL-1β、TNF-α）和趋化因子的表达。氟非尼酮或Nec-1治疗可减少肾小管上皮细胞发生程序性坏死，并减少血清中乳酸脱氢酶的释放，RIPK3和MLKL的产生也减少。氟非尼酮和Nec-1显著降低TNF-α刺激的人近端肾小管上皮细胞的程序性坏死百分比，抑制MLKL和RIPK3的磷酸化。总之，氟非尼酮和Nec-1在单侧输尿管梗阻诱导的肾纤维化模型中具有有效的抗炎和抗纤维化活性[43]。

在肾缺血再灌注小鼠模型中，通过敲除小鼠RIPK3或MLKL基因，肾小管上皮细胞死亡减少，而且炎症细胞浸润和肾纤维化减轻，巨噬细胞和T淋巴细胞等炎症细胞的招募是导致肾损伤后持续炎症和随后纤维化反应的原因[44]。在单侧输尿管梗阻诱导小鼠肾小管间质纤维化模型中，Nec-1抑制程序性坏死减轻了小鼠肾纤维化，与降低RIPK3、MLKL、TGF-β1的蛋白和mRNA表达有关。肾脏胶原蛋白的积累和成纤维细胞激活减少[5]。庆大霉素是一种针对革兰氏阴性菌的强效氨基糖苷类抗生素，但其肾毒性限制了其临床应用。庆大霉素诱导急性肾损伤的原因主要归因于近端小管细胞的凋亡，然而，阻断细胞凋亡只能部分减弱庆大霉素诱导的急性肾损伤[45]，用庆大霉素诱导小鼠发生急性肾损伤，MLKL、RIPK3表达上调，Nec-1可减轻庆大霉素诱导的程序性坏死以及MLKL和RIPK3的上调，同时Nec-1减轻了肾脏炎症和纤维化，并显著改善了庆大霉素诱导的小鼠肾功能障碍[46]。此外，Nec-1 对肾脏、肝脏和心血管系统有保护作用，这意味着 Nec-1 或其衍生物也可能延缓肾功能的恶化[47]。

4 展望

程序性坏死是近年来新发现的一种不依赖于caspase调节的新型细胞死亡途径，在肾脏疾病中的研究刚起步，虽然程序性坏死在肾纤维化中作用机制的研究已经取得一定进展，但其调控网络非常复杂，具体信号途径并不完全清楚，哪些因素可以触发以及如何触发程序性坏死等问题还需要进一步研究。目前发现靶向抑制程序性坏死发生过程中的一些关键分子RIPK1、RIPK3，有望预防肾纤维化的进展，有理由相信随着对程序性坏死调控和阻断机制研究的进一步阐明，将为肾纤维化的防治提供新的策略。因此，进一步探讨程序性坏死相关通路在肾纤维化中的作用，有利于明确肾纤维化的机制，并且对肾纤维化的治疗靶点确证以及靶向药物的研究具有重要意义。