稳定碳同位素技术在土壤有机碳循环中的研究进展与展望

李彪何俭翔

(1.寒区地理环境监测与空间信息服务黑龙江省重点实验室/哈尔滨师范大学，黑龙江 哈尔滨 150025； 2.黑龙江省寒区生态安全协同创新中心，黑龙江 哈尔滨 150025)

引言

土壤有机碳库是陆地生态系统碳库的重要组成部分，在调节全球碳循环与维持碳平衡方面有着重要作用，其微小变化将深刻影响全球碳循环过程[1]。政府间气候变化专门委员会(IPCC)明确指出自工业革命以来，大气CO2平均含量持续增加，至今已突破400ppm。随着全球气候变暖，土壤碳源/汇问题备受学者关注。土壤固碳增汇潜力取决于土壤碳循环中有机碳的波动程度，土壤碳库周转周期的评估是分析土壤和大气之间碳交换的基础[2]。研究指出，土壤碳库周转受气候、土壤环境及微生物等因素综合影响，因此深入分析土壤有机质来源、光合碳转换规律、土壤固碳潜力及土壤呼吸等成为气候变暖背景下碳循环研究的热点问题。但常规研究手段不足以揭示土壤固碳理及有机碳迁移规律，无法精准掌握有机碳形成过程及转化动态，而稳定同位素技术能够揭示有机碳组分转移动态，有助于定量评价新、老土壤有机碳对碳储量的相对贡献[3]。本文在综述稳定碳同位素概念及原理的基础上，进一步阐述了稳定碳同位素技术在古气候构建、土壤固碳潜力、土壤有机碳与根际微生物相互作用关系、植被光合碳在土壤中转移规律及土壤呼吸区分等方面的应用前景及研究进展，并提出了稳定碳同位素技术在土壤碳循环研究中存在的不足及发展方向。

1 稳定碳同位素技术原理

同位素即具有相同质子数、不同中子数的同一元素的不同核素，可分为稳定同位素和放射性同位素。碳同位素中12C、13C和14C为长期存在的同位素，12C、13C的自然丰度为98.89%和1.11%。且14C为放射性同位素。在稳定同位素地球化学和生态学研究中，物质的同位素组成常用同位素比值δ表示：

δ13C=[(R样品/R标准)-1]×1000‰

表示样品中2种同位素比值相对于某一标准对应比值的相对千分差。

2 稳定δ13C同位素在构建古气候古环境方面的应用

稳定碳同位素技术能够确定沉积物有机质的来源、组成及形成过程。古气候古环境的构建能够指示出随着时间尺度该区域的气候环境变化、地貌类型演替、湖泊/土壤有机质的来源变化等。在进行构建古气候过程中，一般先选取记载有关气候环境变化的载体(湖泊沉积物、陆相沉积物、树木年轮、冰芯等)，再结合准确可靠的历史资料作为辅助工具来构建古气候环境。目前研究大多在δ13C基础上，结合土壤总有机碳(TOC)、总氮(TN)、碳氮比(C/N)、δ15N(稳定氮同位素)等地球化学指标，从而提高构建古气候环境的可靠性与准确性。

2.1 稳定δ13C同位素在陆生植物方面的应用

土壤有机质主要源于陆生高等植物，土壤有机碳分解过程的分馏作用远小于植物光合作用固碳发生的分馏作用，因此沉积物有机质的δ13C值与输入该有机质的陆生植物的δ13C值基本相同。由于植被光合作用固碳途径不同，陆生植物可分为C3植物、C4植物及景天酸代谢(CAM)植物。C3植物主要包括乔木、灌木和一些喜湿耐冷草本类植物，其δ13C值通常为-23.0‰～-30.0‰，均值为-27.0‰；C4植物主要是一些草本植物(以藜科、禾本科为主)，其δ13C值通常为-9.0‰～-19.0‰，均值为-14.0‰，CAM植物较为特殊，主要生长在沙漠戈壁等极端干旱的环境中[4]。若已知土壤有机质δ13C值，则可推断出陆地C3和C4植被对于土壤有机质δ13C的相对贡献率，从而得出C3和C4植被的分布及演替情况。当C4植物出现在C3植物群落中，表层土壤有机质δ13C值首先会发生变化，随着C4植物增多，δ13C值更为富集。此外，大气湿度的变化也会影响δ13C值。由于大气湿度会影响C3植物叶片气孔的传导性，光合作用时植物优先利用叶胞中吸收大气的12CO2，随后在酶作用下12CO2会优先转移到磷酸甘油酸中，使胞间CO2的δ13C富集，合成物δ13C贫化。因不同地区温度、降水量等因素存在差异，故δ13C值指示气候环境变化有所不同。Cui等[5]表明在较干旱地区，温度升高、季节性降水增加可导致C4植物数量呈上升趋势，从而指示气候向偏暖湿方向变化。潘进疆等[4]表明在湿润区，C4植物增多可能是由于该地区的气候环境向偏干旱方向变化引起的。由此可见，δ13C值可以指示区域冷暖干湿变化，为古气候、古环境重建提供有力的理论支撑。

2.2 稳定δ13C同位素在水生植物方面的应用

对于水生植物而言，在光合作用中发生的碳同位素分馏作用决定其δ13C值，且分馏机制原理较为复杂，碳源、DIC浓度、pH、温度等因素都会对其造成影响。由于水生植物光合作用所需的CO2与大气中CO2的关系，主要分为浮游藻类、挺水植物以及沉水植物。浮游植物有机质δ13C值与水溶CO2浓度紧密相关，若水溶CO2浓度充足，浮游植物有机质δ13C值与C3植物δ13C值基本一致；若水溶CO2浓度过低，浮游植物则以湖中HCO3-作为碳源，由于HCO3-的δ13C值较水溶CO2浓度的δ13C大7‰～11‰，因此浮游植物吸收HCO3-后δ13C值显著增大；挺水植物进行光合作用时所需的碳主要源于大气中CO2，其δ13C值为-24‰～-30‰；沉水植物进行光合作用所需的碳主要源于湖水中溶解的HCO3-，其δ13C值为-12‰～-20‰。吴汗等[6]通过稳定碳同位素技术对异龙湖有机质的来源的进行研究，结果表明，主要为湖泊自生，水生植物对有机质的贡献量较大，藻类生物量大幅度增加，外源有机质影响较小，同时δ13C逐渐偏负也指示出湖泊富营养化程度逐渐加剧，其原因可能是藻类利用水溶CO2和有机质降解形成的CO2导致的。Edwards等[7]结合湖泊沉积物纤维素的δ13C与δ18O构建Shield Lake一万年前以来的温度与湿度的变化过程，揭示出冷干、暖干、暖湿及冷湿不同气候演替变化过程。虽然水生植物的δ13C在揭示湖泊古气候环境变化中得到了广泛应用，但水生植物中需考虑次级组分(果胶、纤维素、半纤维素、脂类、木质素等)的影响，次级组分的差异会使其δ13C有所不同，这对阐释湖泊气候变化造成了一定的影响。

3 稳定δ13C同位素在土壤有机碳转化过程中的应用

土壤有机质主要取决于植物光合碳，其是“植物-土壤-大气”系统中碳循环的重要载体，光合碳主要通过作物残渣和根沉积物进入土壤碳库。稳定δ13C同位素技术主要包括天然丰度法、同位素脉冲标记与连续标记技术。天然丰度法主要根据C3与C4植物δ13C值的不同，用于区分植物的C3和C4光合途径以及不同植物功能群结构变化[8]；后两者结合植物光合作用进行标记。在植被-土壤碳循环中，标记可以准确的记录光合碳分布及转移情况，能够更加清晰的阐明植物土壤系统中有机碳的循环变化过程。

3.1 土壤团聚体与土壤有机碳的相互作用

土壤团聚体是土壤结构的重要物质基础和肥力的重要载体，其稳定性也可作为评估土壤抗侵蚀能力与水分流失的重要指标[9]。根据其胶结剂类型分为大团聚体(>250μm)和微团聚体(<250μm)[10]。团聚体稳定性的提高对于增加土壤固碳能力具有重要的作用，但土壤碳库中的碳循环是动态变化的过程，区分土壤中的新有机碳与原有机碳可为碳循环的研究提供更清晰、全面的理论支撑，采用传统的差减法等方法效果并不显著，而采用稳定碳同位素示踪技术可以更加详细准确的指示有机碳的来源、动态变化等过程，能够实现土壤有机“新”、“旧”碳之分，进而推动了土壤碳库中有机碳循环及机理等方面的快速发展。

固碳潜力，即土壤碳的饱和水平或土壤所能容纳碳的最大潜力。已有研究表明，有机碳与土壤团聚体的形成及稳定性紧密相关，土壤有机碳的升高会使大气中CO2的排放降低，促进土壤团聚体的固碳效应并使其稳定性得到提升。与此同时土壤团聚体对土壤有机碳库也就具有一定的调节功能，使其保持动态平衡[11]。此外，也可加入外源有机物料影响土壤有机碳含量，进而影响团聚体的团聚与团聚体结构的稳定性。王超[12]等表明，香蕉秆以0.5%、1.0%与2.0%不同比例的添加和生物炭的添加均增加土壤总有机碳和活性有机碳含量，添加香蕉秆可使水稻土中大团聚体含量增加，稳定性得到提高且2%香蕉秆添加量具有最佳的培肥效果。李虎等[13]研究表明，添加畜禽粪秸秆能提高土壤团聚体有机碳含量、增加大团聚体含量、优化团聚体稳定结构。其中，土壤水稳定团聚体中以0.25～0.053mm粒级团聚体有机碳含量最高。不同土壤团聚体的物理结构差异对外源新碳进入有不同影响程度，进而也影响有机碳组分在土壤中的运移和稳定性。因此，通过研究土壤团聚体形成过程和土壤有机碳相互作用的机理，对改善土壤肥力、增加土壤碳汇及维持碳平衡等方面具有重要作用。

目前对土壤团聚体固碳研究的影响，多数集中在耕作、土地利用、施肥制度等人为活动方面。采取不同的土壤利用措施能够不同程度的影响土壤团聚体的转化与更替变化过程，从而影响土壤有机碳库循环的变化机理。当草地类型转化为耕地类型时，土质松软程度有所变化以及相关气体的流入，导致土壤微生物活性增强，消耗有机质含量加快，团聚体稳定性下降[14]。稳定δ13C技术可以反映土壤团聚体对土壤固碳程度大小，指示团聚体在土壤中的迁移及土壤有机碳动态变化过程。郑楠等[9]采用干筛法与湿筛法分别对城市绿地和农田土壤团聚体进行研究，在干筛法中，城市绿地和农田土壤最大δ13C值均在1～2mm团聚体中；在湿筛法中，城市绿地和农田土壤δ13C值均富集在<0.053mm微团聚体中；表明湿筛法制备土壤团聚体能更好地反映土壤中团聚体周转及土壤有机碳动态变化的胚胎发育模型。Lichter等[15]采用玉米与小麦残茬对土壤团聚体的碳氮含量进行研究，表明保留残茬的大团聚体中δ13C值比未保留残茬其δ13C值大幅度增高，且在微团聚体中也可得出与此相同结论；同时还发现，少量的有机残留物的添加仍具有改善土壤肥力的功能。有学者认为，CO2浓度的升高不能增加外源“新”碳在土壤中的积累量，Dorodnikov等[16]利用δ13Cdepleted-FAC试验研究发现，升高CO2浓度导致新碳在不同密度梯度的土壤有机质中的分布不同，多数外源新碳迁移到游离态有机质中，得出升高CO2浓度并不能增加土壤有机质含量。其原因可能是虽然CO2浓度的升高使输入土壤碳库的新碳增加，但也导致有机质的分解速率加快，进而提高碳周转速度，二者作用相抵消；也可能与时间尺度有关，短期土壤有机碳库并不显著，需进一步研究论证。

3.2 光合碳的微生物机理

根际是指植物根系附近2mm区域生物活动范围，其存在许多尚不清楚的植被与土壤、土壤与微生物之间的相互作用。有机碳通过植被根系转移到土壤碳库，为微生物提供日常生命活动所消耗的能量，从而提高微生物活性与加快代谢过程；微生物可将植物未利用养分与土壤有机态转化为无机态，供植物体吸收利用。土壤微生物多样性对光合碳的响应逐渐成为土壤科学的研究热点之一[17]。为了详细研究根际微生物活动过程，稳定性同位素探针(SIP)技术可为此提供有效途径，可有效阐述微生物对土壤碳库循环影响及更好说明其功能等相关问题。使研究微生物的生命活动过程的准确性、全面性得到进一步提升，同时也能为微生物遗传多样性研究领域作出巨大贡献。

Butler等[18]通过13CO2脉冲标记技术对黑麦草标记期1(活跃根系生长期与快速生长期之间的生长阶段)和标记期2(根系快速生长9d后的生长阶段)进行标记，通过对根际与非根际微生物的PLFA与13C-PLFA分析，表明微生物结构的时间比空间差异更显著，在标记期2中，革兰氏阳性菌(i15：0和a15：0)的PLFA相对丰度较高，但标记程度却比标记期1低，而革兰氏阴性菌情况恰恰相反。在13CO2脉冲标记期1和标记期2中，均发现真菌PLFA(18：2ω6，9)的标记程度最高，可指示出在真菌所需的碳含量较高。Liu等[19]通过13CO2脉冲标记结合C-PLFA-SIP技术，表明了随着水稻的生长微生物所利用的碳含量逐渐增加，同时指示革兰氏阴性菌与真菌尤为显著。SIP技术虽然已广泛应用于植被-土壤-微生物生态系统中，且效果显著。也存在其不足之处，包括灵敏度需提升，未标记物质对标记底物的稀释作用及非靶标微生物对标记代谢物的利用都会影响对目标微生物的鉴定等[20]。因此，SIP技术在揭示土壤微生物的生态过程与功能结构变化、探索土壤碳循环等方面具有巨大的应用前景。

3.3 光合碳在土壤中的转移规律

不同碳库周转速率有所不同，从植物到土壤库间的转移具有时滞效应，δ13C可以有效反映出碳从植物碳库到土壤碳库间的转移过程[21]。Butler J等[22]采用13C脉冲技术对黑麦草进行标记，用来评估随着时间变化光合碳在根际土壤和非根际土壤的迁移速率，结果表明，在1d内黑麦草中超过10%的13C迁移到土壤中，且大部分已被纳入微生物生物量中；1～8d根际土壤和非根际土壤中的13C均显著下降，且根际土壤(下降约为55%)比非根际土壤(下降约为50%)下降更为显著，因此可以得出13C在根际土壤中的周转要快于非根际土壤的结论。冉珊珊等[23]采用13C脉冲技术对互花米草标记，表明互花米草各部分固定的13C值随着标记次数的增加而增加，4次标记后各部分固定13C量占净光合13C总量分配比例为茎>叶>根>根际土壤>土体，且光合碳在各部分均呈现不同程度的增加，总体而言，地上部分固定13C量及分配比例均大于地下部分。邓扬悟等[24]采用13C-CO2脉冲标记结合室内培养技术分析不同生育期下水稻光合碳在不同组织间的分布情况及转移到土壤碳库含量变化，发现水稻初期标记的光合碳输入根系和土壤较多，碳汇能力较强，之后呈下降趋势，但标记的光合碳在土壤和根系中的积累量仍在增多；在水稻-土壤生态系统中，不同时期13C光合碳的分布情况有所不同，分蘖期有30%光合碳用于根系建成并有10%通过根系分泌物进入土壤碳库，成熟期则向籽粒中分配较多，且随着水稻生长时期光合碳在土壤中的分布逐渐减少。由于不同时期植物各部分δ13C值可以准确记录气候环境变化，因此Δδ13C可综合反映植物光合碳与土壤有机碳动态变化过程，诠释植物-土壤生态系统中光合碳在土壤中的转移规律。

4 稳定δ13C同位素在土壤呼吸方面的应用

土壤呼吸是指未受扰动的土壤中所有可以产生CO2的代谢过程，主要分为根源呼吸和根际微生物呼吸，根源呼吸又分为纯根呼吸与土壤微生物呼吸[17]。在土壤呼吸中存在十分复杂且尚不清楚的生物活动过程，且土壤温度、湿度、土壤动物及微生物、pH值、植物类型及人类活动等因素的影响都会对其造成不同程度的影响。土壤呼吸的区分仍是有机碳循环研究的难点。而稳定碳同位素技术目前是最有效的、最准确的研究方法之一。

4.1 根呼吸与土壤微生物呼吸的区分

4.1.113C天然丰度法

土壤微生物呼吸和根际呼吸所需有机质来源不同，前者源于土壤旧有机质，后者则来源于植被输入土壤的新有机质。Millard等[25]对德克萨斯州热带稀疏草原进行研究，表明C3/C4植被演替可以区分土壤各部分呼吸量提供依据，并得出根呼吸占土壤呼吸的49%±13.5%，同时，提出了土壤有机质与植物根组织碳的δ13C可分别代表土壤微生物呼吸和根呼吸的δ13C的假设，但其准确性仍需大量研究论证。Cheng等[26]在短期生长箱对种草进行培养及确保其生长环境稳定，结果表明，根源呼吸占土壤呼吸比例为89%，相对不种草而言，土壤微生物呼吸则下降了37.3%。由此可见，种草可以提高土壤微生物生物活性。该方法可为根源与土壤微生物的区分提供准确有利的直接证据，是研究土壤呼吸这一复杂领域的有力工具，尽管存在分辨率、灵敏度较低等不足，但相对脉冲标记而言不需要进行标记过程，且不具有放射性。

4.1.213C脉冲标记法

13C脉冲标记法包括单次脉冲标记、重复脉冲标记与持续脉冲标记。Wu等[27]采用13C单次脉冲标记法对青藏高原草地进行研究，发现土壤微生物呼吸与根呼吸均在第15天脉冲标记13C达到最高值，前者占土壤呼吸的比例为83.1%、后者占土壤呼吸的比例为16.9%。何敏毅等[28]采用13C脉冲标记研究发现，玉米拔节、抽雄与灌浆期根呼吸占土壤呼吸的比例分别为67.07%、63.31%、28.82%，在灌浆期根呼吸占土壤呼吸比例远小于拔节期与抽雄期。13C脉冲标记法可以通过标记技术分别准确记录根呼吸与土壤微生物呼吸释放出CO2含量，以此对二者进行有效的区分，但值得考虑的是，脉冲标记通常不能对植被碳库实现均匀标记。其中，为了准确获得碳库中根系呼吸释放标记碳的含量，需要多次对标记碳进行测量。

5 问题与展望

综上所述，在土壤有机碳循环的研究中，稳定碳同位素技术早已在土壤有机质来源、土壤固碳机理、植被光合碳微生物机制、光合碳在土壤中转移规律及区分土壤呼吸等方面应用广泛。将TOC、TN、C/N、δ13C和δ15N值等地球化学指标数据相结合可以构建准确、全面的古气候环境，可以为植被-土壤-大气系统中碳循环及环境反演提供科学可靠的技术支撑。随着稳定同位素仪器种类不断增加、自动化不断提高及功能日益完善，该技术在土壤有机碳的研究领域的应用会进入高速发展的新时期。同时，该技术也存在一定的问题与不足之处：同位素比例质谱的测定运行成本高，价格贵；采取同位素连续标记技术，13C标记底物的操作及获取较为困难，且对培养环境要求较为严格，对样品的标记时间、处理与测定样品过程中的相关系数需进一步量化；采用同位素天然丰度进行环境反演，需具备δ13C差异较为明显、有着植被演替历史等条件。

在未来的研究中，还需从以下方面进一步完善。

为了更加清晰地认识土壤有机碳来源、土壤固碳、周转等动态变化过程，应增强稳定δ13C同位素技术对不同植被和生态类型、不同土壤类型碳循环的研究，从而提供更加全面准确的理论依据。

在植被-土壤陆地生态系统中，研究光合碳的循环特征及周转速率时，应将人为活动等外界因素考虑其中，人为活动的干预可能会直接或间接的对δ13C造成影响。自然因素外界因素的结合研究可以为光合碳循环机制与其周转提供系统的、完整的科学依据。

尽管SIP技术可以揭示土壤微生物的生态过程与功能结构变化，但想要更加全面的记录微生物生命活动的机理及其对土壤碳库中有机碳循环的影响变化，仍需要稳定碳同位素技术与其他测试技术相辅，如与分子生物学技术相结合，可以对生态系统碳循环有进一步的了解；与GIS技术相结合，可以拓宽有机碳在周转过程中的研究等。