注射用去甲斑蝥酸钠中甘露醇的含量测定

祝 晶，王 璐，何劼毅，漆欣筑

(贵州省食品药品检验所，贵州 贵阳 550004)

0 引言

去甲斑蝥酸钠是斑蝥素的衍生物之一，是由斑蝥素在碱性条件下制得斑蝥酸钠后，去掉3，4位的2个甲基后得到的化合物。去甲斑蝥酸钠肾毒性和对泌尿系统的刺激明显减轻，而抗癌活性则显著高于斑蝥素，此外还具有较好的升高白细胞及免疫调节的作用，对正常肝细胞有较好的保护作用[1]。研究发现，去甲斑蝥酸钠对肝癌[2]，肺癌[3]，非小细胞癌[4]，鼻咽癌[5]疗效确切，临床已作为抗肿瘤的常规用药。目前国内其制剂有注射用去甲斑蝥酸钠、去甲斑蝥酸钠注射液及去甲斑蝥酸钠氯化钠注射液。

甘露醇(Mannitol)又称D-甘露糖醇，为白色结晶或结晶性粉末，分子式C6H14O6，分子量182.17。由于甘露醇稳定性较好，且在人体内代谢与体内胰岛素无关，不是口腔微生物作用的适合底物而不致龋齿，因而广泛用于食品、医药行业。作为原料，甘露醇可用做脱水药和渗透性利尿药，其注射剂用于降低颅内压和眼内压，利尿，早期肾功能不全，脑水肿与青光眼及烧伤休克等并发的急性肾功能不全等[6]。作为药用辅料，由于其具有抗粘性，可压性，造料性较好，甘露醇常用于药品片剂的填充剂、润滑剂，也在冻干制剂中用作保护剂，赋形剂，其制得的冻干粉针饱满、疏松，常优选于其他赋形剂如乳糖、蔗糖、葡萄糖等[7-9]。但甘露醇也有一些列不良反应，多次静脉注射甘露醇，不仅对于穿刺局部，而且对于邻近的血管及其周围组织也具有更明显的损害作用，在接受静脉输液的病人中，大概率出现程度不同的静脉炎[10]。其利尿作用增加肾脏能量需求, 同时增加了急性肾衰(ARF)发生的机率，严重者发展为尿毒症[11]，还可能引起过敏性休克，致神经系统，呼吸系统，循环系统受到损伤[12]。查阅相关文献，甘露醇每次使用剂量不宜超过100 g，每天总量不宜超过300 g，每日尿量少于1 500 mL的患者要慎用[13]。

本次抽验涉及到2个厂家(厂家A，B)生产的注射用去甲斑蝥酸钠3批次(A1、B1、B2)，执行2个检验标准[14-15]。经调研，2个厂家生产的注射用去甲斑蝥酸钠均选用甘露醇作为辅料，处方中甘露醇的使用比例不同(收集到B厂家的处方量，甘露醇加入量为95%)，且均未对甘露醇进行含量控制。考虑甘露醇可能会带来的不良反应，因此，对各厂家样品中所含的甘露醇进行测定，有效控制注射用去甲斑蝥酸钠中甘露醇的含量是十分有必要的。甘露醇属于六元醇极性化合物，自身没有紫外吸收，在常规的C18柱上几乎无保留。查阅相关文献，目前对于甘露醇定量分析的方法也多为高效液相色谱-示差折光检测法(HPLC-RID)，色谱柱选用强离子钙型交换柱，此方法专属性较好，适用于复杂体系中甘露醇含量的测定，专属性好，准确度灵敏度高[16-17]。因此，本实验建立HPLC-RID法测定注射用去甲斑蝥酸钠中甘露醇含量，并进行方法学考察，为该品种的辅料用量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 实验仪器

高效液相色谱仪(Ultimate 3000)，示差折光检测器(Thermo SHOKO)；XS-205型电子分析天平(瑞士梅特勒公司)、超声仪(型号：KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司)、纯水机(UPL-I-30EZ，四川优普超纯科技有限公司)；色谱柱：Carbomix Ca-NP10：8%(7.8 mm×300 mm，10 μm，柱号：251008-7830)。

1.1.2 实验试剂与试药

甘露醇对照品(100533-201103，中检院，98.5%)，自制超纯水，注射用去甲斑蝥酸钠3批次(A厂家1批次，编号A1；B厂家2批次，编号B1、B2)，规格：10 mg/瓶。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用磺化交联的苯乙烯二乙烯基苯共聚物为填充剂的强离子钙型交换柱，以水为流动相，流速0.5 mL/min，柱温80 ℃，示差折光检测器，检测温度为55 ℃，测定效果良好。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取甘露醇对照品50.0 mg，置10 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备

精密称取样品(编号B2)适量，置50 mL量瓶中，加适量水超声溶解，稀释成1 mL含甘露醇约5 mg的溶液，摇匀，即得。

2.2.3 阴性溶液的制备

按注射用去甲斑蝥酸钠的处方制备不含甘露醇的阴性样品，按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法同法制备，即得。

2.2.4 系统适用性试验

分别精密吸取上述对照品溶液，供试品溶液及阴性溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图。阴性样品未见吸收峰，无干扰。供试品中甘露醇峰的保留时间与对照品溶液中甘露醇峰的保留时间一致。甘露醇峰与相邻峰的分离度达到要求，理论板数按甘露醇峰计不低于3 000，见图1所示。

图1 甘露醇对照品(A)、注射用去甲斑蝥酸钠供试品(B)和阴性样品(C)的HPLC-RID色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.1”项下的甘露醇对照品溶液10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL和50 μL(对应分别含甘露醇0.049 36 mg、0.074 04 mg、0.098 70 mg、0.123 4 mg、0.148 1 mg和0.246 8 mg)注入高效液相色谱仪中，按“2.1”项下的色谱条件测定，记录色谱图。并以对照品的量(mg)为横坐标,峰面积的值为纵坐标，进行线性回归。得回归方程y=0.003 5x+0.000 3，r=0.999 9。结果表明甘露醇在0.049 36～0.246 8 mg范围内呈良好的线性关系。

2.3.2 精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下的甘露醇对照品溶液20 μL注入高效液相色谱仪，重复进样6次，测定峰面积，峰面积RSD为0.19%，说明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验

按“2.2.2”项下的方法，平行制备6份供试品(编号1至6)，精密吸取样品溶液20 μL注入高效液相色谱仪中，测定峰面积，计算甘露醇的含量(mg/g)，平均含量为954.20 mg/g，6份供试品含量的RSD为0.30%，重复性结果良好。

2.3.4 稳定性试验

取“2.3.3”项下的供试品1，在室温下每0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h和24 h，各精密吸取供试品溶液20 μL注入高效液相色谱仪中，测定峰面积，峰面积的RSD为0.35%。表明样品在24 h内稳定。

2.3.5 回收率试验

精密称取甘露醇对照品约500 mg，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密称量本品适量(相当于含甘露醇60 mg、 50 mg、40 mg)，分别置10 mL量瓶中，高浓度精密加入对照品贮备溶液6 mL、中浓度精密加入对照品贮备溶液5 mL、低浓度精密加入对照品贮备溶液4 mL，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，即得高、中、低3个浓度供试品共9份，各精密吸取20 μL注入高效液相色谱仪中，测定峰面积，计算回收率为：98.47%、100.49%、99.72%、100.15%、99.27%、98.89%、98.84%、99.39%、98.82%，平均回收率为99.34%，RSD为0.68%，回收率结果良好。

2.3.6 检出限与定量限的测定

精密称取甘露醇对照品适量，配成不同浓度样品按上述色谱条件进行测定，得到甘露醇的检出限为6.734 8 ng，定量限为20.204 3 ng。

2.4 样品含量测定

按上述实验方法和色谱条件对3个批次的样品进行含量测定，A厂家的样品A1平均含量为345.748 5 mg/g(装量0.2 g)，B厂家的样品B1，B2的含量分别为952.522 5 mg/g及954.189 6 mg/g(装量0.3 g)。厂家B含量测定结果与处方量基本一致且批次间控制较好。虽未收集到厂家A的处方，但从结果可以看出，因处方和工艺不同，两个厂家甘露醇的实测量有较大的差异。

3 结果与讨论

1)注射用去甲斑蝥酸钠中的辅料为氢氧化钠和甘露醇，根据调研提示加入过量氢氧化钠的目的是与去甲斑蝥素反应生成目标主药去甲斑蝥素钠，再加入盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节配液罐中的pH值，所以去甲斑蝥素钠的主要辅料是甘露醇。根据查阅文献和药典规定，建立注射用去甲斑蝥素钠中甘露醇的检验方法，目的在于对此类药品中的甘露醇进行用量控制。

2)在试验中所检测到的3批样品，A1测定结果为345.748 5 mg/g，B1、B2测定结果为952.522 5 mg/g和954.189 6 mg/g，注射用去甲斑蝥酸钠的每日最大使用剂量均为60 mg(6支)，按每日最大使用量计算按甘露醇的每日最大用量为0.4 g至2 g之间，甘露醇每次使用剂量不宜超过100 g，每天总量不宜超过300 g，2个厂家样品中的甘露醇虽然没有超过引起不良反应的计量，但此产品的目标使用者多为癌症病人，其身体已经非常虚弱，所以应尽量减少药物中的其他成分的不良反应带来的伤害。且各厂家的甘露醇用量存在较大差异，因此还是有必要对甘露醇进行合理控制，完善注射用去甲斑蝥酸钠的检验标准，从而提高注射用去甲斑蝥酸钠的整体质量。

3)本实验建立了HPLC-RID方法，此方法专属性强，准确度较高，精密度及稳定性良好，可用作注射用斑蝥酸钠中辅料甘露醇的含量测定方法，为以后提高和完善注射用斑蝥酸钠的检验标准提供参考。